REVISIONES BIBLIOGRÁFICAS

Efecto de la adición de antioxidantes sobre la motilidad espermática post-criopreservación y fertilidad del semen de peces

 

Rodríguez, M.; Nivia, A.

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente (ECAPMA), Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD), Sede Nacional Calle 14 Sur Nº 14-23, Bogotá, CP 110911, Colombia, PBX: (+57)1344 3700. E-mail: alexander.nivia@unad.edu.co

 

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Resumen

La criopreservación de semen produce daños celulares a nivel de membranas plasmáticas, mitocondria y ADN, debido principalmente a la formación de cristales de hielo intra y extracelulares, así como al estrés osmótico y oxidativo generado. Para minimizar estos daños se utilizan medios diluyentes que simulan las características fisiológicas del semen y contienen sustancias crioprotectoras, las cuales con ayuda de algunos antioxidantes proporcionan una mayor supervivencia espermática post-descongelación y mejoría de las tasas de motilidad y fertilidad. La adición de antioxidantes enzimáticos como superóxido dismutasa, catalasa y peróxidasa durante el proceso de criopreservación de células espermáticas en peces, no favorece las tasas de motilidad espermática post-descongelación ni de fertilización en las especies trucha arco iris y de arroyo, mientras que los no enzimáticos (methylenediphosphonic- acid/MDPA, butil-hidroxitolueno/BHT, cisteína, propóleo, ácido ascórbico, lisina y carnitina) las mejoran de forma significativa en especies como esturión beluga, carpa común, esturión ruso y trucha arco iris. Los antioxidantes producen diversos efectos especie-específicos tanto en variables de calidad espermática como fertilidad y su efectividad depende de la concentración y el medio diluyente utilizado. Se concluye que la utilización de antioxidantes no enzimáticos en la criopreservación de semen de especies acuícolas como carpa común, esturión y trucha, resulta indispensable para mejorar la motilidad y fertilidad espermática.

Palabras clave: peces, antioxidantes, criopreservación, motilidad, fertilidad.

 

Abstract

Semen cryopreservation produces cellular damage to the plasma membranes, mitochondria and DNA mainly due to the formation of intra- and extracellular ice crystals, as well as due to the osmotic and oxidative stress generated. To minimize this damage, diluent mediums are used. They simulate the physiological characteristics of semen and contain cryoprotectants and some antioxidants which provide increased post-thaw sperm survival and improve motility and fertility rates. The addition of enzymatic antioxidants such as superoxide dismutase, catalase and peroxidase during cryopreservation of sperm cells in fish do not improve rates sperm motility post-thawed neither fertilization in the species rainbow trout and brook trout, whereas non-enzymatic (methylenediphosphonic-acid/MDPA, butil-hidroxitolueno/BHT, cysteine, propolis, ascorbic acid, lysine and carnitine) significantly improved such parameters in species such as beluga sturgeon, common carp, Russian sturgeon and rainbow trout. Antioxidants produce different effects on species-specific variables sperm quality and fertility and their effectiveness depends on the concentration and the diluent medium used. It can be concluded that the use of non-enzymatic antioxidants in semen cryopreservation aquaculture species such as common carp, sturgeon and trout are essential to improve sperm motility and fertility.

Key words: fish, antioxidants, cryopreservation, motility, fertility.

 

Recibido: 9 noviembre 2016

Aceptado: 29 junio 2017

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INTRODUCCIÓN

El La criopreservación del semen de peces es una técnica de gran interés para la piscicultura, ya que permite la conservación de gametos tanto de especies productivas como de aquéllas en vía de extinción, así como crear bancos de germoplasma ¹⁶.

Sin embargo, este proceso produce daños celulares en los espermatozoides, tanto a nivel de la membrana plasmática como en las mitocondrias y el ácido desoxiribonucleico (ADN), debido a la formación de cristales de hielo intra y extracelularmente, así como también por el estrés osmótico y oxidativo que provocan los procesos de congelación y descongelación ⁷³.

Para minimizar estos daños se han utilizado diversos medios diluyentes que no solo permiten su almacenamiento por largos periodos de tiempo, sino que también simulan las características fisiológicas del esperma ⁵⁵. Estos medios diluyentes contienen a su vez una o más sustancias crioprotectoras como dimetilsulfóxido ²², metanol ³⁹, dimetilacetamida ⁴⁵ y metilenglicol ³⁶.

 

Los antioxidantes

Con el fin de proporcionar una mayor sobrevivencia espermática post-descongelación, se han utilizado diversos tipos de antioxidantes de índole enzimática y no enzimática, los cuales favorecen la respuesta de variables como la motilidad, viabilidad e integridad del ADN ⁴⁶.

Adicionalmente, se ha reportado que combaten el estrés oxidativo generado por el desbalance entre la producción y eliminación de las especies reactivas de oxigeno (ERO) durante los procesos de congelación y descongelación ⁶².

También se ha encontrado que el uso de antioxidantes como el butil hidroxitolueno (BHT) en los medios de criopreservación de semen de algunas especies, mejoran los porcentajes de fertilidad, expresando una mejor tasa de producción de embriones y por ende de eclosión.

 

Objetivo

La presente revisión tiene como objetivo comparar las propiedades y respuestas de los diferentes tipos de antioxidantes que han sido utilizados en protocolos de crioconservación de semen de las especies acuícolas: trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha de arroyo (Salvelinus fontinalis), esturión ruso (Acipenser gueldenstaedtii), esturión beluga (Huso huso) y carpa común (Ciprynus carpio), así como el efecto que producen sobre la fertilidad y la motilidad espermática post-criopreservación.

 

Funciones de los antioxidantes

Un antioxidante se define como una sustancia que cuando está presente en bajas concentraciones, en comparación con un sustrato oxidable, reduce o inhibe significativamente la oxidación de dicho sustrato ³¹.

Los antioxidantes tienen diversas funciones, como no permitir que moléculas se unan al oxígeno, al reaccionar e interactuar más rápido con las especies reactivas de oxígeno en un determinado microambiente ³¹, dismutar el oxígeno para formar el peróxido de hidrógeno y proteger a las células contra el anión superóxido, y regular la permeabilidad de la membrana plasmática impidiendo su peroxidación lipídica ⁷².

 

Usos en criopreservación

Los antioxidantes se usan como aditivos de los medios diluyentes durante el proceso de criopreservación, para aumentar el éxito del protocolo y obtener mejores tasas de motilidad y fertilidad espermática ^{9, 18, 58}.

En células espermáticas son usados para mitigar los efectos de la criopreservación y adicionalmente retardar o prevenir la oxidación de la membrana lipídica causada por radicales libres, los cuales se producen en la mitocondria a través de la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) dependiente de la vía oxidoreductasa y en la misma membrana a través de nicotinamida adenina di-nucleótido fosfatasa (NADP+) dependiente del sistema oxidasa, durante el proceso de congelación y descongelación ^{1, 3}.

 

Efectos sobre las células espermáticas

Como producto del metabolismo celular se producen grandes cantidades de radicales libres ⁷, los cuales se encuentran clasificados como EROs (anión superóxido, anión peróxido, radical perhidroxilo, radical hidroxilo) y como especies reactivas de nitrógeno (óxido nítrico, radical peroxinitrito).

Estas sustancias son producidas por mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, membrana nuclear, citoplasma y retículo endoplásmico; sin embargo, también son generadas por factores externos como la contaminación ambiental, la exposición a radiaciones ionizantes, el tabaco, los medicamentos, los aditivos químicos en alimentos procesados y algunos pesticidas, herbicidas y fungicidas ⁶⁰.

Cuando se realiza la criopreservación de células espermáticas, el sistema antioxidante enzimático (superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa) se activa convirtiendo al anión superóxido (O₂-) en peróxido de hidrógeno (H₂O₂) e impidiendo la aparición de iones hidroxilos, altamente tóxicos ². El peróxido de hidrógeno atraviesa los compartimientos celulares sin interactuar con el NADPH, ácidos nucleicos, proteínas ni lípidos, siendo usado por las células para su maduración y capacitación ⁶⁸.

Por su parte, el sistema de defensa no enzimática está compuesto por una serie de diversos compuestos químicos que son incorporados a través de la dieta, los cuales cumplen algunas funciones como impedir las reacciones en cadena producidas por el radical hidroperóxido durante la peroxidación lipídica 48 o proteger a las lipoproteínas de la membrana plasmática contra la oxidación ⁶⁹.

 

Uso en criopreservación de espermatozoides de peces

Diversos estudios en peces han evaluado el efecto de la adición de antioxidantes a los medios diluyentes, sobre el porcentaje de motilidad espermática post-descongelación y su fertilidad, los cuales se han llevado a cabo en especies como: trucha arco iris ^{38, 40}, trucha de arroyo ⁴⁰, esturión ruso ⁴⁴, esturión beluga ⁵² y carpa común ^{49, 50, 51}. Los antioxidantes evaluados fueron de dos tipos: enzimáticos y no enzimáticos.

 

Antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos

Los antioxidantes enzimáticos catalasa, superóxido dismutasa y peroxidasa se han evaluado en los salmónidos trucha arco iris ^{38, 40} y trucha de arroyo ⁴⁰. Los antioxidantes no enzimáticos tipo vitamina (C, E y trolox) se han utilizado en las especies trucha arco iris 38 , esturión ruso ⁴⁴ y esturión beluga ⁵²; los tipos aminoácido (lisina, metionina, cisteína y taurina) en trucha arco iris ^{22, 38, 40}, esturión ruso ⁴⁴, y carpa común ⁴⁹.

Los compuestos naturales β-caroteno y propóleo se han valorado en trucha arco iris 38 y carpa común ⁴⁹, los compuestos sintéticos (3,5-di-ter-butil-4-hidroxifenil (MDPA) y butilhidroxitolueno (BHT) en esturión beluga y carpa común ^{50, 52} y las sustancias químicas ácido úrico, carnitina y glutatión en sus formas reducida y oxidada, fueron ensayadas en las especies trucha arco iris ^{38, 40} y de arroyo ⁴⁰.

 

Utilidad en la criopreservación de semen

La adición de los diferentes tipos de antioxidantes a los medios diluyentes ha producido diversos efectos especie-específicos en parámetros como la motilidad y fertilidad de los espermatozoides de peces.

Anteriores estudios han reportado que los antioxidantes no enzimáticos (vitamina C, lisina, cisteína, metionina, vitamina E, glutatión reducido, L-carnitina, ácido úrico, propóleo, MDPA, BHT, mezcla glutatión reducido y oxidado) lograron optimizar la función mitocondrial en los procesos de criopreservación de esperma de cuatro especies de peces (Tabla 1).

 

Tabla 1. Antioxidantes no enzimáticos que optimizaron la función mitocondrial durante el proceso de criopreservación del semen de peces.

GSSG: glutatión oxidado; GSH: glutatión reducido; MDPA: 3,5-di-ter-butil-4-hidroxifenil; BHT: butilhidroxitolueno, MC: tasa de motilidad espermática posdescongelación del control; MA: tasa de motilidad espermática post-descongelación con el antioxidante. Elaborada en base a datos de Mirzoyan 2006 ⁴⁴, Kutluyer 2014 ³⁸, Öğretmen 2014 ⁴⁹, Öğretmen & Inanan 2014 ⁵⁰, Osipova 2014 ⁵², Öğretmen 2015 ⁵¹.

 

Sin embargo, los antioxidantes como vitamina C, lisina, cisteína, propóleo, MDPA, BHT, mezcla glutatión reducido y oxidado y L-carnitina, aumentaron de forma simultánea las tasas de motilidad espermática post-descongelación y de fertilización (Tabla 2).

Otros estudios mostraron un efecto diverso al utilizar las vitaminas las C y E como antioxidantes en los procesos de criopreservación de espermatozoides de especies animales como conejos ⁷⁴, bovinos ^{26, 32}, equinos ²⁷, porcinos y humanos ^{14, 67}. Resultados similares fueron obtenidos al utilizar como antioxidantes los aminoácidos lisina, cisteína y metionina, en células espermáticas de caprinos ^{70, 71} y bovinos ¹³.

De igual forma, se reportó el mismo efecto cuando se utilizó propóleo y BHT en espermatozoides de caprinos ^{18, 34, 47} y porcinos ⁵⁶ , así como l-carnitina en seres humanos ⁸, felinos ⁴¹, caprinos ⁷¹ y roedores ⁵³, el glutatión en su forma reducida (GSH) en personas ²⁹ y porcinos ²⁸, el glutatión oxidado (GSSH) y la mezcla de glutatión reducido y oxidado en bovinos ¹³.

 

Tabla 2. Antioxidantes no enzimáticos que aumentaron de forma simultánea las tasas de motilidad espermática post-descongelación y de fertilización en peces.

GSSG: glutatión oxidado; GSH: glutatión reducido; MDPA: 3,5-di-terbutil- 4-hidroxifenil; BHT: butilhidroxitolueno; MC: tasa de motilidad espermática posdescongelación del control; MA: tasa de motilidad espermática post-descongelación con el antioxidante; FC: tasa de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante. Elaborada en base a datos de Mirzoyan 2006 ⁴⁴, Kutluyer 2014 ³⁸, Öğretmen 2014 ⁴⁹, Öğretmen & Inanan 2014 ⁵⁰, Osipova 2014 ⁵², Öğretmen 2015 ⁵¹.

 

El efecto benéfico de antioxidantes como cisteína, lisina, metionina, ácido ascórbico y carnitina, representado por el aumento de la motilidad, podría estar relacionado con el hecho de que la cisteína -al ser adicionada a medios diluyentes- refuerza el aumento de la producción de glutatión, tanto intra como extracelular, lo cual ayuda a prevenir la pérdida de la motilidad espermática debida a la formación de iones peróxido ¹³.

Asímismo, la lisina junto con metionina y ácido ascórbico, son esenciales para la biosíntesis de carnitina, la cual es un antioxidante fundamental para metabolizar los ácidos grasos de cadena larga en el interior del citosol de las mitocondrias, donde al ser degradados se convierten en energía (ATP) para ser luego utilizada por las células espermáticas para aumentar su motilidad ¹⁵. Adicionalmente, la carnitina ayuda a proteger la membrana fosfolipídica del espermatozoide contra la peroxidación lipídica ⁵³.

De igual forma, el efecto reportado por el propóleo podría estar relacionado con la inducción de la activación de enzimas como la superóxido dismutasa ³³ y la catalasa ⁶⁶, las cuales protegen al organismo del ataque de radicales y al ADN contra el daño oxidativo producido por el malondialdehído durante la peroxidación lipídica ⁵⁹.

De otra parte, MDPA, BHT y alfa tocoferol, dado que son compuestos fenólicos estéricamente impedidos, funcionan como antioxidantes atrapando los radicales oxi y peroxi ³⁵. Las altas tasas de motilidad y fertilidad reportadas con el uso de MDPA y BHT se deben a la propiedad redox que tienen estos compuestos permitiendo la absorción y neutralización de los radicales libres, protegiendo a las células espermáticas de la oxidación y degradación prematura y brindándoles una estabilidad frente los cambios bruscos de temperatura ⁵². Otros autores le atribuyen excelentes resultados al efecto sincrónico de antioxidantes fenólicos estéricamente impedidos con el medio diluyente yema de huevo ^{30, 54}.

También se ha descubierto que los antioxidantes como la metionina reducida, la mezcla de metionina reducida y oxidada y el glutatión oxidado, produjeron menores tasas de motilidad espermática post-descongelación, sin afectar de forma negativa las tasas de fertilización (Tabla 3).

 

Tabla 3. Antioxidantes no enzimáticos que produjeron menores tasas de motilidad espermática post-descongelación sin afectar de forma negativa las tasas de fertilización.

GSSG: glutatión oxidado; OxMet: metionina oxidada; RMet: metionina reducida; MC: tasa de motilidad espermática post-descongelación del control; MA: tasa de motilidad espermática post-descongelación con el antioxidante; FC: tasa de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante. Elaborada en base a datos de Lahnsteiner 2011 ⁴⁰, Kutluyer 2014 ³⁸.

 

En estos casos se puede inferir que tales antioxidantes produjeron una fragmentación del ADN, la cual provocó la disminución de la motilidad espermática sin afectar las tasas de fertilización, debido a que en algunas especies de peces y mamíferos, los ovocitos pudieron haber activado el sistema enzimático de reparación del ADN propio actuando sobre el ADN de los espermatozoides, reparándolo y permitiendo que se realice la fertilización y el normal desarrollo de los embriones ^{5, 37}.

La utilización del glutatión, tanto individual como combinada en sus formas reducida y oxidada, produjo resultados variables debido a su concentración durante el proceso de criopreservación (Tabla 4).

 

Tabla 4. Antioxidantes no enzimáticos que presentaron resultados variables durante el proceso de criopreservación.

GSSG: glutatión oxidado; GSH: glutatión reducido; MC: tasa de motilidad espermática post-descongelación del control; MA: tasa de motilidad espermática post-descongelación con el antioxidante; FC: tasa de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante. Elaborada en base a datos de Lahnsteiner 2011 ⁴⁰, Kutluyer 2014 ³⁸.

 

Se ha reportado que durante la criopreservación los niveles de glutatión decrecen en los espermatozoides ^{28, 29}. Siendo así, al añadir altas cantidades para compensar el efecto se evidenciaría una alteración de la homeostasis celular. Un investigador reportó que el glutatión se encuentra dentro de las células en una alta concentración (5-10 mM), predominando la forma reducida (GSH) sobre la oxidada (GSSG) y que cuando se produce un aumento o disminución en la proporción de alguno de ellos, es afectado el equilibrio interno de la célula ²¹.

Por el contrario, se ha descubierto que los antioxidantes enzimáticos como catalasa, superóxido dismutasa y peróxidasa, así como los no enzimáticos (trolox, taurina y β-caroteno) no lograron mejorar de forma significativa las tasas de motilidad y fertilidad en peces.

Estos resultados han sido similares o inferiores a los obtenidas con los diluyentes estándares (Tabla 5).

 

Tabla 5. Antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos que no mejoraron de forma significativa las tasas de motilidad y fertilidad en peces durante el proceso de criopreservación.

SOD: superóxido dismutasa; CAT: catalasa; PER: peroxidasa, MC: tasa de motilidad espermática post-descongelación del control; MA: tasa de motilidad espermática post-descongelación con el antioxidante; FC: tasa de fertilidad del control; FA: tasa de fertilidad con el antioxidante. Elaborada en base a datos de Lahnsteiner 2011 ⁴⁰, Ekici 2012 ²², Kutluyer 2014 ³⁸, Osipova 2014 ⁵².

 

Otros estudios mostraron un efecto diverso al utilizar la superóxido dismutasa (SOD) como antioxidante en los procesos de criopreservación de espermatozoides de especies animales como caprinos ^{12, 65}, porcinos ⁵⁷, aves ⁴, equinos ¹¹, simios ⁴³ y caninos ¹⁹. Similares efectos se constataron cuando se empleó la catalasa en espermatozoides humanos ⁴⁶, porcinos ⁵⁷, bovinos ²⁴ y ciervos ²³ y de igual forma, el trolox en equinos ⁶⁴ y caprinos ⁶³, la taurina en bovinos ^{20, 54} y caprinos ⁶ y finalmente, los carotenoides como la luteína y crocin en semen de porcinos y caprinos ^{25, 42}.

Los antioxidantes enzimáticos no lograron incrementar las tasas de motilidad y fertilidad debido a que las altas concentraciones de las enzimas pudieron ser toxicas para las células. En un estudio se reportó que 50 U/mL de SOD eran suficientes para mantener la viabilidad espermática postdescongelación en el esperma de gallos; sin embargo, a medida que se acrecentaba la concentración del antioxidante en el medio, aumentaba la toxicidad ⁴.

La respuesta contraria presentada por la enzima superóxido dismutasa (250 U/l) en la trucha arco iris, podría haberse debido a la composición del medio diluyente utilizado ^{38, 40}. Un estudio reportó que durante la criopreservación se producen resultados variables utilizando el mismo antioxidante, cuando los medios diluyentes con los que se trabaja poseen distintas composiciones ⁵⁴.

Por otra parte, el efecto negativo en cuanto a las tasas de motilidad espermática y fertilidad reportado al utilizar antioxidantes enzimáticos (catalasa, superóxido dismutasa y peróxidasa) y no enzimáticos (trolox, taurina y β-caroteno), estuvo influenciado por la concentración, dado que no potencializó la función del medio diluyente, ocasionando daños en el ADN mitocondrial y nuclear durante el proceso de la criopreservación, afectando la síntesis de proteínas involucradas en la producción de energía celular y también el proteoma ¹⁷.

En una investigación se reportó la desaparición de 21 proteínas espermáticas después de la criopreservación, las cuales contenían los factores de transcripción de genes importantes no solo para la motilidad sino para la fusión del ovocito con el espermatozoide ⁷⁵.

Se afirma que la variabilidad de los resultados obtenidos para los parámetros relacionados con la motilidad espermática y su fertilidad frente a la adición de antioxidantes en los medios diluyentes utilizados en los procesos de criopreservación de espermatozoides, se debe principalmente al tipo de antioxidante y a las diferencias especie-especificas expresadas en el grado de susceptibilidad al estrés oxidativo, así como también al mismo protocolo utilizado durante la criopreservación ^{10, 61}.

 

CONCLUSIONES

Los antioxidantes adicionados a los medios diluyentes durante los procesos de criopreservación de espermatozoides presentan propiedades especie-especificas; por lo cual se evidencia una variabilidad en la respuesta de parámetros de calidad espermática y fertilidad.

La respuesta de las variables de motilidad espermática post-criopreservación y fertilidad, se ven afectadas directamente por el tipo de antioxidante utilizado, su concentración y el medio diluyente al que son adicionados.

Los antioxidantes enzimáticos como superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasa producen bajas tasas de motilidad espermática post-descongelación, sin mejoría de las tasas de fertilización en las especies acuícolas (truchas arco iris y de arroyo).

Los antioxidantes no enzimáticos como MDPA, BHT, cisteína, propóleo, ácido ascórbico, lisina y carnitina, mejoran de manera significativa la motilidad espermática post-descongelación y las tasas de fertilización en las especies esturión beluga, carpa común, esturión ruso y trucha arco iris.

 

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