Introducción

Helicobacter pylori, bacilo Gram negativo, fue declarado como la principal causa de úlcera péptica y cáncer en seres humanos por la Organización Mundial de la Salud en el año 1994. La prevalencia mundial de la infección por H. pylori es mayor al 50%, constituyendo un problema de salud pública²⁰.

Se han descrito especies del género Helicobacter en una amplia variedad de huéspedes animales. Cuando estas bacterias son identificadas por su morfología y no a nivel de especie, se utiliza el término Helicobacter no H. pylori “non-H. pylori helicobacters’’ (NHPH) ⁽⁹. El porcentaje de pacientes infectados con NHPH varía entre 0.2% y 6% ⁵. La infección con estos NHPH en forma de espiral, en seres humanos se ha asociado con gastritis, ulceración gástrica y linfoma MALT gástrico ¹².

El aislamiento de Helicobacter sp de varios animales, que en su mayoría viven en entornos humanos, los hace sospechosos de albergar H. pylori en sus estómagos y por lo tanto participar en la transmisión de este patógeno¹⁴. Vivir en proximidad cercana con gatos, perros y en especial cerdos, se ha identificado como un factor de riesgo para estas infecciones ¹⁰. Además, algunos autores consideran a Helicobacter como bacteria patógena emergente transmisible por los alimentos ¹¹.

En cerdos la prevalencia de Helicobacter suis en el estómago al momento del sacrificio varía del 8 al 95%^4,5. Investigaciones mostraron que de las infecciones humanas con NHPH del 13,9% al 30,9% corresponden a H. suis³⁰, siendo después del H. pylori el más frecuente en seres humanos¹⁶.

En porcinos se ha logrado reproducir úlcera gástrica mediante la inoculación experimental con H. pylori¹. La similitud morfológica entre la úlcera porcina y la humana no implica una patogénesis similar, pero sugiere la presencia de mecanismos comunes para su desarrollo ¹³.

Se han propuesto varios factores de virulencia para H. pylori, algunos de ellos asociados al proceso de colonización y otros sindicados con el daño en la mucosa gástrica²⁹. En el proceso de colonización, la capa de moco es la primer barrera que los patógenos gástricos deben superar. Los componentes principales de la capa mucosa son glicoproteínas de mucina densamente glucosiladas ²⁴. H. pylori se fija a la superficie o a las uniones intercelulares del epitelio gástrico generando daños en el mismo ¹⁵.

La lamina propia adyacente atrae células defensivas, infiltrándose con polimorfonucleares y mononu-cleares¹⁵. La inflamación crónica disminuye la concentración de células D (productoras de somatostatinas) y la hipergastrinemia resultante, incrementa la secreción de jugo gástrico. El desbalance entre factores agresivos (incrementados) y defensivo (disminuidos), pueden expresarse como una lesión ulcerada ⁶.

Los glicoconjugados se encuentran en diferentes componentes del tracto gastrointestinal, entre ellas las células de la mucosa gástrica ⁷. Poseen una amplia variedad de funciones como: intervención en el proceso de reconocimiento célula-célula, protección de las células epiteliales contra valores de pH extremos o de las enzimas hidrolíticas, unión e inhibición de células citotóxicas, entre otras ⁸, cumpliendo así un papel importante en la protección del epitelio, aunque pudiendo también facilitar la adhesión de bacterias al mismo ²¹.

El patrón de glicosilación puede sufrir modificaciones debido tanto a cambios fisiológicos como a procesos patológicos. El conocimiento del patrón de glicosilación en condiciones normales es esencial para evaluar sus modificaciones en diversas patologías y tener mayor comprensión de su patogenie. Las lectinas constituyen una herramienta fiable para ello ²¹.

El uso de los modelos animales para el estudio de la helicobacteriosis ha sido amplio a nivel mundial, lo cual ha permitido grandes avances en cuanto al conocimiento de la epidemiologia, infección y patogenia de Helicobacter en la enfermedad gástrica humana¹⁹.

El cerdo -por su condición anatómica- presenta mucha similitud con el ser humano, siendo el modelo de elección para el estudio de la infección por Helicobacter, su interacción con otros agentes patógenos virus- bacteria y la carcinogénesis gástrica²².

El objetivo del presente trabajo fue analizar el comportamiento del glicoconjugado glucosa/manosa a través de la técnica de lectinhistoquímica en la mucosa gástrica de cerdos afectados por gastritis producida por Helicobacter sp.

Material y Métodos

La toma de muestras de estómago de cerdos (n=50), su procesamiento por la técnica histológica convencional y el posterior diagnóstico de gastritis (crónicas/agudas) y presencia/ausencia de Helicobacter sp son parte de un trabajo previo realizado por este mismo grupo de investigación ³⁰.

En todos los casos se trató de animales destinados a faena y considerados libres de enfermedad de acuerdo al examen clínico y post-mortem realizado. El trabajo contó con el aval del Comité de Ética de la Universidad Nacional de Río Cuarto (Córdoba).

Las muestras fueron clasificadas en diferentes grupos de estudios:

Grupo A: cerdos G/H+: cerdos con gastritis agudas y presencia de Helicobacter sp.

Grupo B: cerdos G/H-: cerdos con gastritis agudas sin presencia de Helicobacter sp.

Grupo C: cerdos G/H+: cerdos con gastritis crónicas y presencia de Helicobacter sp.

Grupo D: cerdos G/H-: cerdos con gastritis crónicas sin presencia de Helicobacter sp.

Grupo E: cerdos con mucosas gástricas normales

Para la determinación del glicoconjugado glucosa/ manosa en la mucosa gástrica a través de la técnica de lectinhistoquímica, se utilizó como marcador la lectina vegetal biotinilada con canavalina A (con A). Como reveladores: el complejo universal avidina-biotina- peroxidasa (ABC) y como substrato de la enzima: la diaminobencidina (DAB).

Las muestras fueron observadas con un microscopio Orthoplan. Se realizó la adquisición de imágenes a través de una cámara digital. Carl Zeiss AxioCam ERc 5s.

Los resultados obtenidos en la técnica lectín- histoquímica fueron expresados en forma cualitativa determinando que: (-): negativo, (±): pobre marcación, (+): moderada marcación, (++): abundante marcación, (+++): cuantiosa marcación.

Posteriormente, para el análisis cuantitativo, se determinó la distribución de la intensidad de inmuno- marcación a través del valor de High Score (HS), donde para cada muestra, el valor HS derivó de la sumatoria de los porcentajes de tejido epitelial gástrico marcado para cada intensidad, multiplicado por el ponderado para esa intensidad de marcación. High Score = a pi (i + 1). i = intensidad de marcación. pi = % de tejido marcado para cada intensidad.

En cada preparado, cinco áreas seleccionadas al azar fueron evaluadas bajo un microscopio de luz con un aumento de 40X, utilizando la puntuación media ²⁸.

Resultados

En el Grupo A se apreció una pobre marcación epitelial (+/-), una lámina propia con una marcación homogénea que va de abundante (++) a cuantiosa (+++) y glándulas con una marcación moderada (+) a cuantiosa (+++) de distribución heterogénea (Figura 1-A).

Las muestras correspondientes a mucosa gástrica pertenecientes al Grupo B, revelaron la presencia del glicoconjugado glucosa/manosa en epitelio con una marcación pobre (+/-) en la región apical a moderada (+) y en algunos casos abundante (++) en la región basal. En lamina propia la marcación fue moderada (+) y de distribución uniforme.

Las glándulas presentaron una marcación de moderada (+) a abundante (++) (Figura 1-B). En el Grupo C se observó un epitelio con pobre marcación (+/-) en la región apical, a moderada (+) en la región basal. La lamina propia presentó una marcación que variaba de abundante (++) a cuantiosa (+++), mientras que las glándulas presentaron una marcación moderada (+) a abundante (++), siendo la distribución uniforme en ambos casos (Figura 1-C).

Las muestras gástricas de cerdos del Grupo D presentaron en el epitelio zonas con una pobre marcación (+/-) y zonas con marcación cuantiosa (+++) distribuidas heterogéneamente. La lamina propia, al igual que las glándulas, presentaron una marcación moderada (+) (Figura 1-D).

Figura 1 Microscopía óptica de muestra gástrica, región antral, técnica de lectin-histoquímica con A 400x. A: mucosa gástrica Grupo A. B: mucosa gástrica Grupo B. C: mucosa gástrica Grupo C. D: mucosa gástrica Grupo D. E: mucosa gástrica Grupo E. Ep: epitelio. LP: lamina propia. G: glándulas 

Figura 2 Valores medios de la variable HS para Lectina Con A con sus respectivas desviaciones estándar. A: epitelio. B: glándulas. C: lámina propia. G.A: grupo A. G.B: grupo B. G.C: grupo C. G.D: grupo D. G.E: grupo E. 

En la mucosa gástrica antral normal (Grupo E), se pudo visualizar una marcación cuantiosa (+++) y uniforme del epitelio y las glándulas, así como una tinción abundante (++) de la lámina propia (Figura 1-E).

Cuando se evaluó mediante el análisis estadístico la intensidad de marcación del epitelio en los diferentes grupos, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión del glicoconjugado glucosa/manosa (Figura 2-A). En cuanto a las glándulas, el análisis estadístico reveló una distribución homogénea de la marcación en los diferentes grupos cuyas diferencias no eran estadísticamente significativas (Figura 2-B).

En relación a la lámina propia, el estudio estadístico (Figura 2-C) evidenció diferencias significativas entre el Grupo A y el Grupo E, existiendo una marcación cuantiosa del primero en relación al segundo grupo. Diferencias significativas también se presentaron entre el Grupo A y el Grupo B, presentándose como en el caso anterior una marcación cuantiosa en el Grupo A en relación al Grupo B.

Discusión

Los hidratos de carbono en las superficies celulares desempeñan un papel clave en el proceso de reconocimiento de célula-célula, y en la adhesión de los microorganismos a las células huésped a través de proteínas de unión a carbohidratos llamados lectinas ² como ocurre con Helicobacter sp²⁵.

Por lo tanto, conocer el patrón de glicosilación es de alta relevancia fisiopatológica durante el proceso de infección ²¹. Debido a la diversidad de especies de Helicobacter y a su capacidad para colonizar de manera eficiente el estómago de mamíferos, se ha propuesto que estas bacterias podrían causar lesiones gástricas en animales de forma análoga a las producidas en el ser humano ^26,27.

La similitud morfológica entre la úlcera porcina y la humana, sugiere mecanismos comunes para su desarrollo, esto sumado a las características anatómicas semejantes entre ambas especies, hacen del cerdo el modelo de elección para el estudio de la infección por Helicobacter^22,26.

Existen pocos registros de trabajos realizados en animales que aborden el estudio del patrón de glicosilación en mucosa gástrica con Helicobacter spp, especialmente a través de la lectina Con A.

En especies como el cobayo, se analizó el patrón de expresión de los residuos de azúcar de la mucosa gástrica infectada por H. pylori, diagnosticada con gastritis crónica activa y no infectada mediante las lectinas Triticum vulgaris (WGA), Sambuccus nigra (SNA- I), Ulex europaeus (UEA-I), Helix pomatia (HPA) y Phaseolus vulgaris (PHA-L).

Aunque se encontraron intensidades de tinción heterogéneas para las mismas lectinas, no se hallaron diferencias significativas entre los grupos. Sin embargo, los patrones de glucosa/manosa no fueron estudiados mediante la lectina Con A ¹⁷.

En seres humanos se estudiaron a través de lectinhistoquímica, muestras de biopsias de mucosa gástrica normal y diagnosticadas con gastritis crónica activa e infectadas con H. pylori³. Observaron diferencias significativas entre las reacciones de tinción de glicoconjugados para las lectinas UEA-I, Concanavalina A succinilada (SCA) y Arachis hypogaea (PNA).

La tinción para glucosa/manosa (unida por SCA) fue negativa en el moco extracelular y la membrana apical del epitelio de la mucosa normal, mientras que las mismas regiones fueron positivas en mucosa infectada por H. pylori.

Investigadores¹⁸ analizaron mediante microscopia óptica y microscópica de fluorescencia, la capa mucosa superficial de biopsias gástricas humanas diagnosticadas con gastritis crónica activa positivos a H. pylori y mucosas normales mediante las lectinas WGA y Con A.

Los resultados indicaron para la lectina Con A un patrón de unión intensa en el grupo mucosa normal, mientras que la unión fue débil a negativa en el grupo positivo a H. pylori. Por otro lado, el patrón de unión fue difuso para la lectina WGA en ambos grupos. Estos resultados sugieren un cambio significativo en los restos de hidratos de carbono presentes en la superficie de las células gástricas durante la infección ^18,23.

Los resultados obtenidos en nuestro estudio indican diferencias estadísticamente significativas en la ex­ presión de glucosa/manosa solo en lámina propia, entre los grupos gastritis aguda Helicobacter (+) y mucosa normal, observándose una marcación cuantiosa en el primero con respecto al segundo y entre los grupos gastritis aguda Helicobacter (+) y gastritis aguda Helicobacter (-) presentándose como en el caso anterior una marcación mayor en el grupo gastritis aguda Helicobacter (+).

En conclusión, los resultados estadísticos de este estudio revelan que existe relación entre el aumento en la marcación de glucosa/manosa y la presencia de Helicobacter spp. en lamina propia de mucosa gástrica de cerdos.