Espanhol (pdf)
Artigo em XML
Referências do artigo
Tradução automática
Enviar este artigo por email
Citado por SciELO 
Similares em
SciELO 
Permalink
Introducción
Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados: bacterias planctónicas -de libre flotación- y bacterias que forman biofilms o comunidades, que son aquéllas que cuando se enfrentan a una superficie, se adhieren a ella y a continuación, elaboran señales químicas para coordinar dichas comunidades 6.
Los biofilms están estructurados principalmente por grandes colonias de bacterias incrustadas en una matriz polimérica extracelular5,16. La capacidad de crear biofilms no parece estar restringida a ningún grupo específico de microorganismos y hoy se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas, todos los microorganismos son capaces de formarlos 9.
Las bacterias patógenas tienen la capacidad de adherirse y formar biofilms en diversos sistemas, incluyendo superficies, equipos y/o utensilios de la industria alimenticia, donde crean una fuente permanente de contaminación del alimento. La matriz orgánica de un biofilm proporciona a los microorganismos una barrera protectora extraordinaria frente a agresiones externas.
Se estima que los microorganismos presentes en un biofilm pueden ser mil veces más resistentes a los des infectantes convencionales que las bacterias en estado planctónico. Esto puede conducir a la contaminación de los alimentos y al desarrollo de enfermedades, como así también a pérdidas económicas debido al rechazo del producto 1.
Además del riesgo de contaminación, el desarrollo de biofilms puede interferir en diferentes procesos y causar daños en equipos. En sistemas de agua potable, estas comunidades pueden obstruir las cañerías disminuyendo su velocidad y capacidad de transporte, originando un incremento en el consumo energético. En las superficies metálicas pueden causar corrosión debido a la producción de ácido por las bacterias 4.
Dichas contaminaciones pueden ser provocadas por numerosas especies de microorganismos de deterioro, como así también patógenos, entre los que se destacan: STEC, Salmonella sp y S. aureus. Las bacterias, sobre todo patógenas, pueden adherirse a casi cualquier tipo de superficie, como plástico, metal, vidrio, madera, partículas del suelo y productos alimenticios 10.
Por lo tanto, en la industria alimentaria resulta fundamental su tratamiento ya que podrían derivar en la producción de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). La Organización Mundial de la Salud (OMS) determina que las ETA vinculan a biofilms y trastornos digestivos debido a una posible contaminación cruzada durante el proceso de producción de alimentos. De esta manera, se puede establecer una relación entre los microorganismos que habitan en una planta de producción y el alimento que se produce en la misma. Esto pone en riesgo la salud de los consumidores y el renombre de la empresa que ha expedido los alimentos en cuestión 7.
Por otro lado, se ha demostrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden formar biofilms sobre material biótico y abiótico para fines industriales o funcionan como efectores antagonistas contra varios patógenos transmitidos por los alimentos en el modo de crecimiento planctónico o biofilms17.
Lactobacillus sp es un género bacteriano ampliamente utilizado como probiótico. En los últimos años, el interés por los probióticos como complementos nutricionales ha aumentado significativamente y el concepto se está aplicando en diferentes y variadas matrices. Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum LP5) tiene una gran capacidad para adaptarse a nichos ambientales y la particularidad de presentar capacidad antibacteriana frente a diferentes bacterias patógenas 14.
El objetivo de este estudio fue evaluar el uso de L. plantarum LP5 como método de control in vitro de la formación de biofilms por patógenos involucrados en ETA como Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), Salmonella tiphymurium (S. tiphymurium) y Staphylococcus aureus (S. aureus).
Material y métodos
Selección y condiciones de crecimiento de las cepas
Las cepas patógenas involucradas en la producción de ETA seleccionadas para los distintos tratamientos fueron: STEC O157:H7 (EDL933) aislada de un caso clínico de síndrome urémico hemolítico (SUH) y S. Tiphymurium y S. aureus aisladas previamente de criaderos de cerdos y boca de expendio de carne de cerdo respectivamente, en el Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de Buenos Aires2. Las tres cepas patógenas fueron activadas en caldo Luria Bertani (LB, Britania, Argentina) durante 24 h a 37°C en aerobiosis.
La BAL utilizada fue L. plantarum LP5 de origen porcino identificada previamente por secuenciación de Sanger del 16S ribosomal y probada actividad antibacteriana in vitro contra patógenos involucrados en brotes alimentarios: STEC, S. Typhimurium, S. aureus y C. coli13,14. L. plantarum LP5 fue activado en caldo Man Rogosa Sharpe (MRS, Britania, Argentina) durante 24 h a 37°C en aerobiosis.
Las cepas patógenas y L. plantarum LP5 fueron conservadas en caldo LB (Britania, Argentina), y MRS (Britania, Arg.) respectivamente, con 20% de glicerol a -0°C.
Evaluación de reducción de biofilms de bacterias patógenas
La capacidad de las BAL de reducir biofilms de las bacterias patógenas se realizó con base en una técnica descripta anteriormente 18, con modificaciones. Fueron utilizadas placas de 24 pocillos de fondo plano conteniendo vidrios circulares de 1 mm de espesor, removibles. Se realizaron tres ensayos:
Competencia: L. plantarum LP5 y las bacterias patógenas fueron co-cultivadas en los pocillos. Una concentración de 105UFC/ml (unidades formadoras de colonias/ml) de ambos cultivos (L. plantarum LP5 y STEC, L. plantarum y S. Tiphymurium y L. plantarum y S. aureus) fue colocada en diferentes pocillos. Las placas se incubaron a 37°C durante 72 h en aerobiosis. Los vidrios fueron lavados conphosphate buffered saline (PBS, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 140 mM, KCl 3 mM) pH 7,1 colocados en tubos con 5 ml de solución fisiológica (ClNa 0,85%) y agitados durante 2 h.
De cada tubo, fueron sembrados 100 μl en placas de MRS (Britania, Argentina) para recuento de L. plantarum LP5 y MacConkey (Britania, Argentina) para STEC, Salmonella-Shigella (S-S, Britania, Argentina) para S. Tiphymurium y Agar Manitol Salado (AMS, Britania, Argentina) para S. aureus. Los cultivos pa tógenos fueron incubados a 37°C durante 24 h en aerobiosis y L. plantarum LP5 a 37°C durante 24 h en anaerobiosis.
Exclusión: en cada pocillo fue colocado L. plantarum LP5 en una concentración de 105 UFC/ml e incubado a 37°C durante 72 h. Los vidrios fueron lavados con PBS pH 7,1 (Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 1 mM, NaCl 140 mM, KCl 3 mM) y colocados en nuevos pocillos. Las bacterias patógenas en una concentración de 105 UFC/ml fueron inoculadas sobre los pocillos con biofilms de L. plantarum LP5.
Incubación. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 72 h en aerobiosis. Los vidrios fueron lavados con PBS pH 7,1(Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 1 mM, NaCl 140 mM, KCl3 mM), colocados en tubos con 5 ml de solución fisiológica (ClNa 0,85%) y agitados durante 2 h. De cada tubo, fueron sembrados 100 μl en los medios y en las condiciones previamente mencionadas para cada una de las bacterias buscadas.
Desplazamiento
En cada pocillo fueron colocadas las bacterias patógenas en una concentración de 105 UFC/ml e incubadas a 37°C durante 72 h. Los vidrios fueron lavados con PBS pH 7,1 (Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 1 mM, NaCl 140 mM, KCl 3 mM) y colocados en nuevos pocillos. L. plantarum LP5 en una concentración de 105 UFC/ml fue inoculado sobre los pocillos con biofilms de los patógenos.
Las placas fueron incubadas a 37°C durante 72 h en aerobiosis. Los vidrios fueron lavados con PBS pH 7,1 (Na2 HPO4 10 mM, KH2 PO4 1 mM, NaCl 140 mM, KCl 3 mM), colocados en tubos con 5 ml de solución fisiológica (ClNa 0,85%) y agitados durante 2 h. De cada tubo, fueron sembrados 100 μl en los medios y en las condiciones previamente mencionadas para cada una de las bacterias buscadas.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se llevaron a cabo tres veces, con muestras triplicadas por ensayo, y los resultados se expresaron como promedio. Las desviaciones estándar fueron determinadas con el programa Excel (Microsoft Corp., EEUU). Una prueba “t” en el intervalo de confianza del 95% con PASW Statistics SPSS 17 (IBM Co.) fue realizada para determinar la significación estadística de los datos.
Resultados
Reducción de biofilms de patógenos por competencia
El ensayo de competencia mostró una cuantificación promedio de STEC y de L. plantarum LP5 más STEC de 4,99 log10 UFC/ml y 1,83 logwUFC/ml, respectivamente; de S. Tiphymurium y de L. plantarum LP5 más S. Tiphymurium de 5,25 log10 UFC/ml y 1,74 log10 UFC/ml, respectivamente; y de S. aureus y de L. plantarum LP5 más S. aureus de 5,29 log10 UFC/ml y 1,34 log10 UFC/ml, respectivamente.
Reducción de biofilms de patógenos por exclusión
El ensayo de exclusión mostró una cuantificación promedio de STEC y de L. plantarum LP5 más STEC de 4,96 log10 UFC/ml y 1,42 log10 UFC/ml, respectivamente; de S. Tiphymurium y de L. plantarum LP5 más S. Tiphymurium de 5,27 log10 UFC/ml y 1,24 log10 UFC/ ml, respectivamente; y de S. aureus y de L. plantarum LP5 más S. aureus de 5,01 log10 UFC/ml y 1,19 log10 UFC/ml, respectivamente. La producción de biofilms de STEC, S. Tiphymurium y S. aureus fue menor que la producción de biofilms de cada patógeno co-cultivado con L. plantarum LP5 (p<0,01; Figura 1).
Reducción de biofilms de patógenos por desplazamiento
El ensayo de desplazamiento mostró una cuantificación promedio de STEC y de L. plantarum LP5 más STEC de 4,52 log10 UFC/ml y 3,32 log10 UFC/ml, respectivamente; de S. Tiphymurium y de S .Tiphymurium y de L. plantarum LP5 más S. Tiphymurium de 3,90 log10 UFC/ml y 1,44 log10 UFC/ml, respectivamente; y de S. aureus y de L. plantarum LP5 más S. aureus de 2,07 log10 UFC/ml y 4,56 log10 UFC/ml, respectivamente (Figura 1).
Figura 1 Cuantificación de bacterias patógenas y L. plantarum LP5 en los ensayos de competencia, exclusión y desplazamiento.
La producción de biofilms de STEC y de S. Tiphymurium fue menor que la producción de biofilms de los dos patógenos cuando fue incorporado el cultivo de L. plantarum LP5 (p<0,01; Figura 1). Por el contrario, la producción de biofilms de S. aureus fue mayor que la producción de biofilms de S. aureus cuando fue incorporado el cultivo de L. plantarum LP5 (p<0,01, Figura 1).
Las medias identificadas con letras diferentes indican diferencias significativas (p<0,05) entre L. plantarum LP5 y STEC, L. plantarum LP5 y S. Tiphymurium y L. plantarum LP5 y S. aureus para cada ensayo (competencia, exclusión y desplazamiento). Las barras indican la desviación estándar.
Discusión
La presencia de biofilms representa una preocupación en la industria alimentaria porque las bacterias pueden adherirse a casi cualquier tipo de superficie, como plástico, metal, vidrio, partículas de suelo y productos alimenticios de madera 7.
En el presente estudio in vitro fue demostrada la característica antagónica de L. plantarum LP5 frente a bacterias patógenas sobre una superficie abiótica como el vidrio. Estos resultados concuerdan con quienes evidenciaron que bacterias del género Lactobacillus sp presentan acción antibacteriana natural sobre biofilms de bacterias patógenas adheridas a superficies como poliestireno y acero inoxidable 12 .
En otro estudio, la actividad de formación de bio- films se realizó in vitro en dos materiales: vidrio y poliestireno y la mayor actividad antagónica se mostró contra S. aureus y STEC19. Otros investigadores7, también obtuvieron resultados similares ante Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 y Salmonella Tiphymurium en placas de poliestireno utilizando especies de BAL.
En el ensayo de competencia, mediante co-cultivo de L. plantarum LP5 y cada uno de los patógenos, fue observada una notable reducción de los biofilms de STEC, S. Tiphymurium y S. aureus. Estos resultados son consistentes con los estudios reportados previamente por investigadores que por competencia y/o producción de metabolitos13,14 confirmaron la capacidad antibacteriana de Lactobacillus sp y L. plantarum LP5, respectivamente.
En el ensayo de exclusión, en el que sobre un biofilm formado por L. plantarum LP5 se adiciona cada cultivo patógeno, fue observada una inhibición de la formación de biofilms de STEC, S. Tiphymurium y S. aureus. Estos resultados coinciden con quienes evaluaron la capacidad de un aislado de Lactobacillus sp. Para formar un biofilm fuerte, que proporcionaría el efecto inhibidor contra varias bacterias patógenas 8,11 .
La capacidad de BAL para inhibir la formación de biofilms de Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, E. coli y S. Tiphymurium podría estar mediada por la presencia de metabolitos antimicrobianos17. Un estudio de secuenciación de genoma completo demostró que L. plantarum LP5 presenta genes codificantes de planta ricinas (datos no publicados). Así, la producción de compuestos proteínicos activos antimicrobianos, explicaría la capacidad protectora del medio, que impide la formación de biofilms por bacterias patógenas.
En el ensayo de desplazamiento, en el que sobre un biofilm formado por cada patógeno, se adiciona la cepa potencialmente probiótica, los resultados variaron. Sobre el biofilm formado por STEC y por S. Tiphymurium, L. plantarum LP5 produjo un efecto reductor.
La matriz establecida por los patógenos no fue lo suficientemente consistente para resistir la capacidad antimicrobiana de L. plantarum LP5. De esta forma, la capacidad antimicrobiana de L. plantarum LP5 ha superado la matriz establecida por los patógenos que generalmente protege la región periférica del biofilm patógeno 15.
Por otro lado, el biofilm formado por S. aureus, logró resistir el efecto antibacteriano de L. plantarum LP5. Esta particularidad de S. aureus podría ser explicada por el mecanismo de supervivencia por formación de biofilms que le otorga resistencia a los antimicrobianos. No obstante, la OMS lo ha incluido en la categoría de “alta” prioridad de patógenos resistentes a los antibióticos que representan una amenaza para la salud pública 15.
Woo y Ahn 18 demostraron la actividad inhibitoria de diferentes Lactobacillus sp sobre biofilms a través de mecanismos de competición, exclusión y desplazamiento, similares a los del presente estudio. Otros 3 han evaluado probióticos comerciales para inhibir, competir y desplazar la adhesión de patógenos potenciales, siendo necesario evaluar cada BAL con el patógeno específico.
Recientemente se informó que las BAL presentaban características potenciales como alternativas para el control de la formación de biofilms de bacterias patógenas en la industria alimentaria, sin conferir un riesgo a los consumidores 7 .
En conclusión, este estudio demuestra que L. plantarum LP5, disminuye en gran medida la formación de biofilms de STEC, S. Tiphymurium y S. aureus principalmente por competencia y exclusión. Por lo tanto, el uso de biofilms potencialmente probióticos, puede ser un enfoque alternativo para reducir la formación de biofilms de bacterias patógenas involucradas en ETA en las industrias alimentarias.
