ARTICULO ORIGINAL

Agrobacterium rhizogenes vs inducción auxínica para la rizogénesis in vitro de Prosopis chilensis (mol.) stuntz

Agrobacterium rhizogenes vs auxinic induction for the rizogenesis in vitro of Prosopis chilensis (mol.) stuntz

Luis Caro¹, P. Marinangeli¹, N.R. Curvetto^1,2 y L. Hernández^1,3

1 Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca (8000)

2 CONICET, Bs. Aires (1033) y

3 CICBA, La Plata (1900), Argentina. (lcaro@criba.edu.ar)

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RESUMEN

Se evaluó la efectividad de Agrobacterium rhizogenes (Ar), cepa LBA 9402, para inducir y eventualmente mejorar la formación in vitro de raíces de Prosopis chilensis, en presencia o ausencia de ácido indol-3-butírico (AIB).

Los explantos consistieron en segmentos uninodales provenientes de plántulas de un mes de edad criadas in vitro a partir de semillas, los cuales se cultivaron en tubos de ensayo que contenían perlita saturada con medio basal líquido Broadleaved Tree Medium (MB), con sus sales mayores reducidas a la mitad de su concentración original a pH 5,8, con un fotoperíodo de 16/8 (luz/oscuridad) y a 25 ± 2°C.

Los segmentos fueron distribuidos en seis tratamientos: 1) MB (control); 2) Inmersión en AIB 1’ (3 ppm); 3) MB + AIB (3 ppm); 4) Inoculación con Ar 1’; 5) Inmersión en AIB 1´(3 ppm) + inoculación con Ar 1’, y 6) Inoculación con Ar 1’ + MB + AIB (3 ppm).

A los 10 días de cultivo, los explantos fueron transferidos a medio basal fresco solidificado con agar y libre de auxinas. Los segmentos inoculados con Ar fueron subcultivados en un MB que contenían cefotaxina (500 ppm). A los 30 días de subcultivo se determinó el porcentaje de enraizamiento, el número de raíces por explanto, el largo de las raíces y el peso seco de raíces.

El porcentaje de enraizamiento y el número de raíces primarias por explanto, fue superior en los microvástagos inoculados, llegando al 100% cuando además se sometieron a la acción del AIB (3 ppm) por inmersión. La inoculación de los segmentos produjo un número de raíces por explanto significativamente mayor y con un peso seco significativamente también mayor en comparación a los segmentos no inoculados.

Los tratamientos con A. rhizogenes resultaron en una mejor respuesta de enraizamiento, pero el tratamiento con AIB en el medio de cultivo sin inoculación produjo un buen porcentaje de enraizamiento, con más de dos raíces por explanto y con buena biomasa de raíces.

Palabras clave: Acido indol-3- butírico; Agrobacterium rhizogenes; Enraizamiento; Prosopis chilensis

SUMMARY

This work assesses the effectiveness of Agrobacterium rhizogenes (Ar), LBA 9402 strain, to induce and to eventually improve the formation of in vitro roots of Prosopis chilensis, with the presence or absence of indol-3-butirico acid (AIB). The explants consisted of uninodal segments proceeding from seedlings one month old raised in vitro from the seeds. They were cultivated in tubes containing saturated perlite, with liquid basal environment Broadleaved Tree Medium (MB), with the major salts reduced to half of the original concentration at 5.7 pH, with a 16/8 photo-period (light/darkness) and at 25 ± 2°C.

The segments were distributed in six treatments: 1) MB (control); 2) 1' immersion in AIB (3 ppm); 3) MB + AIB (3 ppm); 4) inoculation with Ar 1'; 5) immersion in AIB 1' (3 ppm) + inoculation with Ar 1', and 6) inoculation with Ar 1' + MB + AIB (3 ppm). After ten days of culture the explants were transferred to a fresh basal environment solidified with agar and free of auxines. Those segments inoculated with Ar were sub-cultured in an MB containing cefotaxine (500 ppm). After 30 days of subculture the rooting percentage, number of roots by explant, length and dry weight of roots were determined. The rooting percentage and the number of primary roots per explant was higher in the inoculated micro-shoots, reaching 100% when the remaining underwent the AIB (3 ppm) action through immersion. The inoculation of the segments produced a number of roots per explant significantly higher and with a dry weight also significantly higher compared with those noninoculated segments.

The treatments with A. rhizogenes resulted in a better rooting response, but the AIB treatment in the culture environment without inoculation produced a good rooting percentage, with more than two roots per explant and a good root biomass.

Key words: Agrobacterium rhizogenes; Indole-3-butiryc acid; Prosopis chilensis; Rooting

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INTRODUCCIÓN

La propagación sexual es la vía más común de obtener nuevos ejemplares del Algarrobo de Chile (Prosopis chilensis Mol. Stuntz) en viveros, pero lamentablemente muchas características forestales selectas se pierden de este modo.

Se presenta entonces la alternativa de su micropropagación como técnica capaz de conservar las características deseables de individuos "elite". La micropropagación de plantas elite de P. chilensis (Caro et al., 2002) posibilitaría entonces una propagación vegetativa con rápida ganancia de caracteres génicos deseables en programas de mejoramiento forestal.

En la micropropagación in vitro de especies forestales, se ha observado un desarrolllo radical deficiente de los explantos incidiendo negativamente en la implantación de las microplantas a campo (Martínez Pastur et al.,2000).

La infección en la base de microestacas cultivadas in vitro con Agrobacterium rhizogenes (Ar), una bacteria Gram (-) común en el suelo y con capacidad de infectar a vegetales a través de heridas, induciendo abundantes raíces adventicias ("hairy roots") en el sitio de la infección (Tepfer, 1984; Petit et al., 1986; Narasu & Giri, 2000), puede mejorar el enraizamiento de especies leñosas recalcitrantes para el enraizado in vitro (Damiano & Monticelli, 1998; Perez-Molphe & OchoaAlejo, 1998; Hoshino & Mii, 1998; Gutierrez-Pesce et al., 1998). Utilizando diferentes cepas de esta bacteria, varios autores han logrado enraizamientos exitosos en especies de Pinus, Larix, Eucalyptus (McAfee et al., 1993; MacRae & Van Staden, 1993).

Las raíces transformadas son además capaces de regenerar plantas transgénicas enteras o clones, viables y genéticamente estables (Narasu & Giri, 2000). Especies recalcitrantes para su transformación pueden llegar a ser transformadas por inducción génica de la bacteria a través de cocultivo in vitro de Ar y tejidos vegetales cortados (Stachel et al., 1985), aunque la capacidad para transformación varía de acuerdo a las distintas cepas de Ar (Kumar et al., 1991; Giri et al.,1997).

El medio de cultivo induce significativamente sobre la formación de "hairy roots" (Narasu & Giri, 2000). Medios con alta concentración salina como ser MS (Murashige & Skoog, 1962) favorecen la formación de hairy roots en algunas plantas mientras que, medios de baja concentración osmótica tal como BTM (Chalupa, 1983), incrementan la multiplicación bacterial en el medio siendo necesario transferir los explantos varias veces a un medio fresco conteniendo antibiótico (Narasu & Giri, 2000).

El propósito del presente trabajo fue comparar la efectividad de la cepa LBA 9402 de Ar con la correspondiente del ácido indol butírico para inducir y eventualmente mejorar in vitro la formación de raíces en vástagos de P. chilensis.

MATERIAL Y MÉTODO

Material vegetal

Segmentos uninodales de 1-2 cm de longitud, provenientes de plántulas de un mes de edad crecidas in vitro a partir de semillas, fueron cultivados in vitro durante 30 días, en un medio Broadleaved Tree Medium (Chalupa, 1983) con los macronutrientes reducidos a la mitad de su concentración original (BTMm) (Caro et al., 2002). Al cabo de ese período, vástagos conteniendo hojas verdaderas fueron seleccionados, para ser usados en la experiencia de enraizamiento in vitro con Ar y AIB.

Cultivo de las bacterias

Se cultivó la cepa LBA 9402 de Ar a partir de colonia aislada en medio líquido YEB con 50 ppm de rifampicina a 27 °C durante 12-14 horas hasta obtener una lectura de densidad óptica a 600 nm en el rango de 0,6 y 0,8. La concentración bacterial juega un rol importante en la producción de raíces transformadas, concentraciones sub-óptimas podrían resultar en una más baja habilidad de la bacteria para la transformación, y por otra parte, concentraciones elevadas podrían hacer decrecer la capacidad de transfor mación por inhibición competitiva (Kumar et al., 1991).

Cultivo in vitro

Los microvástagos fueron cortados en la base con un escalpelo y distribuidos en seis tratamientos sin desinfección debido a que provenían de un cultivo aséptico de semillas in vitro. Los tratamientos (T) aplicados fueron:

T2: IBA 3 ppm x 1’MB ....................... subcultivo MB

T3: MB + AIB 3 ppm ....................... subcultivo MB

T4: Ar x 1’ MB ....................... subcultivo MB + cefotaxina

T5: AIB 3 ppm x 1’ + Ar x 1’ — MB ....................... subcultivo MB + cefotaxina.

T6: Ar x 1’ MB + AIB 3 ppm ....................... subcultivo MB + cefotaxina.

En todos los tratamientos los microvástagos fueron cultivados en tubos de ensayo que contenían perlita saturada con medio basal BTMm, esterilizado a 0,1 MPa durante 20 min, previo ajuste del pH a 5,8 con KOH 0,5N. La solución de auxina fue esterilizada con filtros Millipore‚ de 0,2m. El cultivo se hizo a 25 ± 2 °C con un fotoperíodo de 16 h de luz fluorescente blanca (PAR = 70 mmol.m^-2.s^-1).

En T2 y T5 los explantos fueron sometidos a una inmersión durante 1 min en AIB (3 ppm) previo al cultivo en BTMm. En T3 y T6 se añadió 3 ppm de AIB al medio basal BTMm. En los tres últimos tratamientos (T4, T5 y T6) los microvástagos fueron inoculados con Ar durante 1 min previo al cultivo en medio basal BTMm.

A los 10 días de cultivo, los MVs fueron subcultivados a medio BTMm solidificado con agar (0,7% p/v) libre de auxinas. Los MVs inoculados con Ar fueron subcultivados en medio basal BTMm que contenían cefotaxina (500 ppm).

A los 30 días de subcultivo se registró el porcentaje de enraizamiento, el número de raíces primarias y peso seco de raíces en los MVs enraizados, y la longitud de los brotes

Diseño y análisis estadístico

Se siguió un diseño estadístico completamente aleatorizado, con dos repeticiones de 25 microvástagos cada una, según el tratamiento. Sobre los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza de doble entrada y los valores medios de los tratamientos se separaron usando el ensayo de Tukey-Kramer.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El porcentaje de enraizamiento fue significativamente superior en los tratamientos con Ar en comparación a los que no fueron inoculados (p = 0,03), llegando al 100% en el tratamiento con Ar e inmersión por un minuto en IBA (Tabla 1).

Tabla 1: Enraizamiento y principales parámetros morfológicos evaluados en los explantos de P. Chilensis en los diferentes tratamientos. Las letras iguales no muestran diferencias significativas (P=0,05)

Table 1: Rooting and main morphological parameters evaluated in the explants of P. chilensis after the treatments. Same letters do not show significant differences (P= 0,05)

Esto último fue similar a la inducción radicular en Simmondsia chinensis informada por Benavides y Radice (1998).

En cuanto al número de raíces primarias, se observó un efecto estimulante tanto en los microvástagos inoculados con Ar como en los tratados con AIB. Si bien, el AIB en el medio de cultivo (T3) produjo un número promedio de raíces por explanto superior al control, con Ar el número de raíces fue aún mayor (Tabla 1).

Al comparar en promedio los tratamientos no inoculados con los inoculados, resultó ser significativamente superior el conjunto de los tratamientos con Ar en el número promedio de raíces y en el peso seco de las mismas (p < 0,01). El número de raíces primarias por explanto se incrementó por encima de tres al suministrar IBA en combinación con Ar, en ambas modalidades de uso de la auxina (Tabla 1).

No se encontraron diferencias en el largo de raíces entre los diferentes tratamientos (p > 0,63) (Tabla 1).

Los microvástagos enraizados mostraron una mayor elongación promedio al ser comparados con vástagos que no presentaban raíces (p < 0,001), 22,78 mm y 9,36 mm, respectivamente. No se observó presencia de raíces en explantos no brotados.

Es importante destacar que si bien los tratamientos con Ar tuvieron una mejor calidad de enraizamiento, el tratamiento con IBA en el medio de cultivo sin Ar (T3) produjo un buen porcentaje de microvástagos con raíz (86%), con más de dos raíces por microvástago y con buena biomasa (2,6 mg de peso seco promedio). Lo anterior recomendaría la elección de este camino si lo que se pretende es la micropropagación. Sin embargo, la rizogénesis mediada por Ar en P. chilensis sería presumiblemente ventajosa si las diferencias en su favor en volumen y peso radical resultasen a campo en una mayor supervivencia y crecimiento.

La elección de una u otra vía rizogénica, en última instancia, dependerá del comportamiento de las microplantas a campo, como por ejemplo una mayor supervivencia y crecimiento.

Una de las grandes ventajas que se aprecian a través de la generación de raíces por Ar es la ausencia de la fase de formación de callos que provoca variación somaclonal. Por otra parte, la presencia de "hairy roots" en P. chilensis posibilitaría además la obtención de individuos con mejor performance de implantación y un camino posible para el mejoramiento de la especie a través de la ingeniería genética. Es bien sabido que los programas clásicos de mejoramiento genético forestal, son lentos y tediosos, resultando sumamente difícil introducir genes específicos a través de ciclos de cruzamiento de líneas parentales. Ar puede ser una alternativa exitosa como ruta rápida y directa de introducción y expresión de genes específicos (Huang et al., 1991).

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Recibido: 08/2000

Aceptado: 10/2000