Introducción
El síndrome de braquiespina (SB) (OMIA 000151-9913) es un trastorno hereditario letal autosómico recesivo de la raza Holstein. El primer caso reportado data del año 2006 en Dinamarca (Agerholm et al., 2006) y desde entonces varios más se han diagnosticado en diferentes países (Agerholm & PeperKamp, 2007; Testoni et al., 2008; Agerholm et al., 2010).
La enfermedad produce mayormente mortalidad embrionaria (Charlier et al., 2012). En algunas ocasiones puede observarse el nacimiento de terneros muertos con marcadas malformaciones como: retraso del crecimiento, braquignatismo inferior, desplazamiento caudal de las orejas, acortamiento de la columna (que da el nombre a la enfermedad) y miembros desproporcionadamente largos que le dan al animal aspecto de alce (Agerholm et al. 2006; Testoni et al., 2008; Agerholm et al., 2010).
El SB es producido por una mutación en el gen FANCI (Fanconi Anemia complementation group I) que se encuentra localizado en el cromosoma bovino BTA 21. FANCI codifica para una proteína monoubicuitinada con un rol fundamental en los procesos de reparación del ADN (Fang et al., 2013). El alelo mutado es producido por una deleción de 3.3 Kb que contiene los exones 25 al 27 del gen y el empalme del exón 24 con el 28 (Charlier et al., 2012), lo que produce una proteína no funcional. La naturaleza de la mutación ha permitido diseñar una prueba diagnóstica simple basada en las técnicas de PCR y electroforesis (Charlier et al., 2012), asignando a los animales genotipados el código internacionalmente reconocido TY (libre de SB) o BY (portador de SB). Gracias a estas técnicas, la enfermedad pudo ser rastreada molecularmente en la mayor parte de los casos al toro de elite americano Sweet Heaven Tradition (023HO00206) nacido en el año 1974 (Fang et al., 2013).
La utilización de toros emparentados con Sweet Heaven Tradition en los programas de mejoramiento genético de la raza permitió que el alelo mutante se propague en las diferentes poblaciones Holstein (Fang et al., 2013). Así lo demuestran varios estudios que detectan portadores para el alelo de la enfermedad a pesar de no reportar casos clínicos (Van Raden et al., 2011; Fang et al., 2013; Sahana et al., 2013; Ruść & Kamiński, 2015; Li et al., 2016).
En Uruguay la enfermedad no ha sido diagnosticada y la presencia del alelo mutante en el rodeo general aún no se ha reportado en la literatura. Por este motivo, el objetivo de este trabajo es determinar la presencia del alelo deletéreo en la raza Holstein de Uruguay.
Materiales y Métodos
Se analizaron los registros de 2598 toros Holstein, nacionales e importados, nacidos entre 1964 y 2014, pertenecientes al catálogo de padres actualizado al año 2018, publicado por Evaluaciones genéticas lecheras, disponible en https://www.geneticalechera.com.uy/. De forma independiente al catálogo de padres, se evaluaron los registros de los toros Holstein pertenecientes a los catálogos de semen lechero disponible para Uruguay entre los años 2014 y 2018, a los efectos de conocer la evolución del ingreso de semen de toros BY al país en los últimos años. Estos catálogos son publicados por la institución de Mejoramiento y Control Lechero Uruguayo y constituyen un material de acceso público (http://www.mu.org.uy/). Cada uno de los registros fue evaluado utilizando las bases de datos de:
Holstein Association USA
ABS Global
(https://bullsearch.absglobal.com/en-us/bull/quick-search)
DairyNZ
(https://www.dairynz.co.nz/animal/animal-evaluation/bull-team/)
World Wire Sires
y Evaluaciones genéticas lecheras (https://www.geneticalechera.com.uy/).
Adicionalmente, se analizaron 71 muestras de ADN de animales Holstein uruguayo, no emparentados, previamente extraídas según el protocolo de Green & Sambrook (2012) a partir de sangre entera periférica colectada entre los años 2014 y 2019. Las muestras provenían del banco de ADN del Área Genética-Facultad de Veterinaria y de la Unidad de Biotecnología del Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA). Las muestras fueron cuantificadas con espectrofotometro Nanodrop ND-1000® (Thermo ScientificTM) y estandarizadas a una concentración de 100ng/µL. Las muestras fueron amplificadas por PCR utilizando los primeros forward: 5’-GCTCAAGTAGTTAGTTGCTCCACTG-3’ y reverse: 5’-ATAAATAAATAAAGCAGGATGCTGAAA-3’ descritos previamente por Charlier et al. (2012). La reacción fue puesta a punto en un volumen final de 25µL conteniendo: 100ng de ADN genómico, 2.5µL de Buffer de PCR 10X (Mg2+: 20mM), 1µM de cada primer, 10mM dNTPs y 0.4µL U-Taq ADN polimerasa (SBS Genetech Co., Ltd., China). La reacción se realizó utilizando termociclador MultiGene II (Labnet Inte-national, INC., EEUU). El programa de termociclado consistió en una desnaturalización inicial a 94ºC por 5 min, seguida de 35 ciclos de amplificación y una etapa final de extensión a 72ºC por 10 min. Cada ciclo de amplificación estaba compuesto por las etapas de: desnaturalización (94ºC, 30 s), hibridación (58ºC, 1 min) y extensión (72ºC, 2.5 min). Los amplicones obtenidos fueron separados mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% y visualizados con un sistema de documentación de geles BIOTOP-SC805 y el software BioSens Gel Imaging System V2.0 (Shanghai Bio-Tech Co., Ltd., China).
Las frecuencias alélicas y genotípicas fueron calculadas para la muestra de referencia del rodeo comercial utilizando el software libre Genepop 4.2 (Raymond & Rousset, 1995) disponible en:
Resultados
Análisis de catálogos
En el análisis del catálogo de padres de las evaluaciones genéticas lecheras se observó que el 90 % (n=2332) de la contribución genética provino de Estados Unidos, Uruguay y Canadá (Tabla 1). De los 2598 toros analizados, solamente un 14,5 % (n=377) contaba con test genético registrado para SB (Tabla 1). De estos, un 7.4% (n=28) fueron portadores (BY), procedentes de Estados Unidos y Canadá. Al evaluar la descendencia de los toros BY en Uruguay se observaron 2198 hijas incluidas en el sistema de evaluación genética nacional (Tabla 1).
En la evaluación de los catálogos de semen lechero disponible para Uruguay entre los años 2014 y 2018 se observó que la mayor contribución genética al rodeo Holstein provino en esos años desde Estados Unidos, Canadá y Nueva Zelanda (Tabla 2). En términos generales se observó un aumento en el ingreso de semen de toros genotipados, salvo algunas excepciones. Al evaluar la relación del número de toros con test diagnóstico para SB y el número de toros portadores (BY) que ingresaron al país en los años 2014-2018 (Figura 1), puede observarse que en la medida en que aumentó la proporción de toros con test diagnóstico oficial, hubo una disminución en el ingreso de semen de toros BY al país.
*Otros:Alemania, Argentina, Australia, Bélgica, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Italia, Suecia. **SD: Sin datos. þAnimales normales. ᴪAnimales portadores.
Análisis molecular
Mediante PCR-electroforesis se lograron identificar cuatro vacas portadoras de braquiespina. En los animales homocigotas dominantes se observó un solo fragmento de amplificación de 3738pb, mientras que los animales portadores presentaron una banda de 3738pb y otra de 409pb (Figura 2). La frecuencia de portadores en la muestra de vacas analizada fue de 0.06 y la frecuencia del alelo mutado fue de 0.03.
Discusión
El catálogo de padres de las evaluaciones genéticas lecheras incluye toros Holstein con al menos una hija incluida en el sistema de evaluación genética para la raza en Uruguay. De su análisis se desprende un fuerte componente de material genético proveniente de Estados Unidos (Tabla 1), donde presumiblemente se originó la mutación fundadora del SB (Fang et al., 2013). Asimismo, se observa la presencia de un componente importante de genética canadiense (Tabla 1), dónde se han reportado casos de SB en los últimos años (Agerholm, et al. 2010).
De la totalidad de toros con información genética que conforman parte del acervo genético de la raza, se detectaron 28 animales portadores del SB (7.4%). El número de toros BY podría ser mayor, dado el bajo número de animales con información genética disponible en las bases de datos públicas respecto a su estatus genético para la enfermedad, incluyendo al 100% de los toros uruguayos (Tabla 1). La alta propor-ción de toros sin test diagnóstico en el catálogo de padres puede ser explicada por el hecho de que este incluye toros anteriores a que el test diagnóstico para la mutación fuera publicado (Charlier et al. 2012). A pesar de ello, la proporción de toros portadores utilizados en Uruguay fue superior al 4.9% reportado por Fang et al. (2013) en toros Holstein de China.
Los animales BY del catálogo de padres contribuyeron genéticamente en los programas de mejoramiento Holstein, dejando un gran número de hijas (n=2198) en los sistemas de evaluación genética (Tabla 1). Dado que el mecanismo de herencia de la enfermedad es autosómico recesivo, debemos asumir que al menos el 50% de las hijas (n=1099) fueron portadoras de SB, lo que indicaría la presencia del alelo mutante en el núcleo de selección uruguayo. Dado que la totalidad de hijas (n=2198) fueron evaluadas para características de producción de leche, estas dejaron descendencia a nivel nacional. Dentro de los toros BY utilizados en Uruguay se destaca la presencia de Rothrock Tradition Leadman (008HO02024), descendiente directo de Sweet Heaven Tradition y uno de los principales difusores del alelo mutante en el mundo (Fang et al., 2013).
En el análisis de los catálogos de semen lechero disponible para Uruguay entre los años 2014 y 2018 (posterior a la publicación del test molecular de diagnóstico para identificar portadores), se puede observar claramente como el porcentaje de toros sin datos (SD) disminuye. En el caso de Canadá de 30% a 9 % y de 22% a 2% para Estados Unidos (Tabla 2). Sin embargo, para Nueva Zelanda, Uruguay y Argentina, el 100% de los animales se mantiene sin test genético disponible. Por otro lado, los toros genotipados provenientes de Holanda y del ítem “otros” disminuyen notoriamente a pesar de que aumenta el ingreso de semen de dichas procedencias (Tabla 2).
En la medida en que aumentó el número de toros genotipados para el SB entre los años 2014 y 2018, disminuyó el ingreso de animales portadores al país. A pesar de ello, entre el 2015 y el 2018 se observó una tendencia en la disminución de animales testeados para SB (Figura 1). Esto se explica por un aumento en el ingreso de semen de Nueva Zelanda y Holanda con escasa información disponible en cuanto al estatus genético para la enfermedad (Tabla 2).
A pesar de que el SB fue identificado hace 14 años, los reportes del alelo mutado en las poblaciones no son muchos. En este trabajo se lograron identificar por PCR y electroforesis vacas portadoras del SB, obteniéndose fragmentos de amplificación (Figura 1) congruentes a los reportados por Charlier et al. (2012) y Fang et al. (2013).
La frecuencia de vacas portadoras encontrada en este trabajo fue menor a la reportada en Holanda (0.07, Charlier et al., 2012), similar a la reportada en Estados Unidos (0.06, Van Raden et al. 2011) y mayor a la encontrada en China y en Holstein nórdico (0.02, Fang et al. 2013 y 0.04, Sahana et al. 2013, respectivamente). En Polonia Ruść y Kamiński (2015) reportan un porcentaje de animales portadores de 10%, mayor al documentado en otros países.
La proporción de vacas portadoras de SB en Uruguay (presente estudio) y en otros rodeos Holstein del mundo es importante (Ruść y Kamiński, 2015) y la utilización de toros BY puede elevarlas significativa-mente. Recientemente Cole et al. (2016) demostraron que los animales BY presentaban un mayor rendimiento de grasa en la leche. Al utilizar toros con alto mérito genético para esa característica, quizás se pueda haber favorecido la dispersión del SB por diferentes países. En el mismo trabajo, y en las condiciones de producción de Estados Unidos, los autores demostraron que el SB es la condición genética que más pérdidas económicas produce en la raza Holstein. A pesar de ello, la eliminación de toros BY de alto mérito genético muchas veces es inviable económicamente, ya que presentan otros genes favorables para características productivas. Dirigir los apareamientos (evitando cruzar portadores) sería una estrategia alternativa para mantener la performance productiva del rodeo. Pero para esto es fundamental aplicar técnicas de diagnóstico molecular que permitan identificar a los animales BY.
Este trabajo representa la primera evidencia de animales BY en el núcleo de selección genética Holstein del país. Asimismo, se comprobó molecularmente la presencia del alelo mutante en el rodeo comercial de la raza. A pesar de la disminución del ingreso de semen de animales portadores, el alelo BY persiste en el rodeo comercial uruguayo. Situaciones similares pueden producirse en la región, por lo que la puesta a punto de técnicas de diagnóstico podrían ser necesarias para reducir la frecuencia del alelo deletéreo y minimizar las pérdidas embrionarias a causa del SB.