INTRODUCCIÓN
El género Marasmius Fr. (Marasmiaceae, Agaricales) está representado por aproximadamente 600 especies de distribución mundial (He et al., 2019), siendo más diverso en las regiones tropicales y subtropicales (Kirk et al., 2008). Este género se caracteriza por sus basidiomas generalmente pequeños a medianos, de consistencia membranácea y reviviscentes al rehidratarse, caracteres que lo hacen soportar condiciones de sequía estacionaria o elevadas temperaturas (Singer, 1986). En Argentina, Marasmius fue estudiado principalmente por Singer & Digilio (1951), Singer (1965, 1976), Raithelhuber (2004), Lechner & Papinutti (2011), Papinutti & Lechner (2011), Niveiro et al. (2018) y Ramírez et al. (2021), conociéndose actualmente más de 90 especies para el norte del país (Niveiro & Albertó, 2013).
En el marco de un proyecto de investigación que trata sobre explorar la diversidad de hongos agaricoides de la Selva Atlántica argentina, se colectaron ejemplares que han sido identificados como Marasmius magnus A.C. Magnago & J.S. Oliveira, una especie llamativa por su tamaño y coloración, recientemente descripta para el sur de Brasil (Magnago et al., 2016). El objetivo del presente trabajo es registrar a M. magnus para la funga argentina, describirla, ilustrarla, y discutir sobre los caracteres diferenciales de especies similares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colección, análisis morfo-anatómico e identificación
Los ejemplares fueron colectados en la provincia de Misiones, en el Parque Provincial Saltos del Moconá y P. P. Salto Encantado. Los mismos fueron fotografiados y descritos macroscópicamente “in situ”. Para la identificación taxonómica se analizaron macro y microscópicamente los ejemplares siguiendo los criterios y terminología propuesta por Vellinga (1988) y Lodge et al. (2004). Los colores siguen los códigos de Kornerup & Wanscher (1978). Para el análisis microscópico, se realizaron cortes a mano alzada a fin de observar los elementos del revestimiento piléico, del contexto del píleo y del pie, basidiosporas, basidios, cistidios y trama himenoforal. Los cortes fueron montados en una solución de hidróxido de potasio (KOH 5%) teñidos con floxina acuosa al 1%, y reactivo de Melzer (Wright & Albertó, 2002). Las medidas de todas las estructuras microscópicas se realizaron mediante fotografías tomadas del microscopio con cámara incorporada Leica EC3 utilizando el software ImageJ (Schneider et al., 2012), y se proporcionan los intervalos del valor mínimo - máximo. Para las basidiosporas se brinda además el valor promedio (x), el coeficiente Q (longitud/diámetro), el valor medio del coeficiente Q (Qx), el número de esporas medidas (n), y el número de basidiomas de los cuales se han medido las esporas (N). Los autores de los nombres científicos se indican de acuerdo al Index Fungorum - Authors of Fungal Names (2021) mientras que las siglas de los herbarios según Thiers (2021). El material colectado fue procesado y posteriormente depositado como referencia en la colección micológica del Instituto de Botánica del Nordeste (CTES).
Extracción, amplificación y secuenciación de ADN
El procesado del material se llevó a cabo en el laboratorio del IBOL (International Barcode of Life Proyect) ubicado en el Instituto de Botánica del Nordeste. La extracción del ADN se realizó a partir de pequeños trozos de tejido fúngico (principalmente del ápice del estípite o del contexto del píleo), previamente deshidratado y conservado en gel de sílice. Para ello, se utilizó el protocolo establecido por el “Barcode of Life Project” (Schoch et al., 2012, www.boldsystems.org).
La región espaciadora del transcrito ribosomal interno (ITS), la cual fue sugerida como marcador universal para el estudio de los hongos (Ivanova et al., 2008; Schoch et al., 2012), fue amplificada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los primers ITS1-F (5’-CTT- GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’) e ITS4-B (5’-CAGGAGACTTGTACACGTCCAG-3’) (Gardes & Bruns, 1993). Para la PCR, se utilizó el protocolo modificado de Ivanova & Grainger (2006), cuyas concentraciones finales fueron 5% de trealosa, 1X de buffer, 2.5 mM de MgCl2, 0.2 µM de cada cebador (directo y reverso), 0.2 mM de dNTPs, 1U de Platinum Taq Polymerasa (Invitrogen), y 30-50 ng/µl de DNA templado. Las condiciones de la reacción fueron las si- guientes: 94 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, alineamiento a 56 °C durante 30 s y elonga- ción a 72 °C durante 45 s; seguido de una exten- sión final a 72 °C durante 10 min. El producto amplificado fue revelado mediante una electro- foresis en gel de agarosa 1% y posteriormente secuenciado en el Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB).
Alineamiento y análisis filogenético
La secuencia obtenida fue ensamblada y editada manualmente utilizando el software Geneious 9.1.4 (Kearse et al., 2012) y depositada en la base de datos del Genbank. Para la construcción de la matriz, se seleccionaron las secuencias más afines (90-100 % de similitud y e-value = 0.0) a través de la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), sumado a las secuencias pertenecientes a la sección Globulares, subsección Globulares de acuerdo a los criterios determinados por Oliveira et al. (2020). Secuencias de M. leveilleanus (Berk.) Sacc. & Trotter, M. tenuissimus (Sacc.) Singer, M. nigrobrunneus (Pat.) Sacc., M. graminum (Lib.) Berk., M. ruforotula Singer, y M. nigrobrunneus f. cinnamoneus Wannathes, Desjardin & Lumyong fueron seleccionadas como grupo externo (Oliveira et al., 2020). Todas las secuencias utilizadas en este estudio se listan en la Tabla 1. El alineamiento se realizó en línea mediante el software MAAFT v.7, bajo el criterio Q-INS-i (Katoh & Standley, 2013). El mismo fue editado manualmente usando MEGA6 (Tamura et al., 2013).
Los análisis de Máxima Verosimilitud (MV) como el de Inferencia Bayesiana (IB), se realizaron a través del portal CIPRES (Miller et al., 2010). Para ello, se utilizaron las matrices enteras y/o subdivididas en tres particiones (ITS1, 5.8S e ITS2). El análisis de MV se llevó a cabo mediante RaxML-HPC v.8 (Stamatakis, 2014). El modelo de sustitución de nucleótidos empleado para generar 1000 réplicas fue GTRGAMMA, mientras que el resto de los parámetros permanecieron por defecto. Sólo se obtuvo el árbol mejor puntuado, y se accedió a la confianza de los nodos mediante Rapid bootstrapping (BS). El análisis de IB se realizó utilizando MrBayes 3.2.7a (Ronquist & Huelsenbeck, 2003; Ronquist et al., 2012). El modelo evolutivo se estimó aplicando el criterio de información de Akaike (AIC) obtenido mediante jModelTest2 v.1.6. (Guindon & Gascuel, 2003; Darriba et al., 2012). Se establecieron dos corridas independientes, cada una de ellas a partir de árboles aleatorios con cuatro cadenas independientes y simultáneas (temp = 0,2). Se llevaron a cabo un total de 2×107 generaciones, muestreando un árbol cada 1000 generaciones. De todos los árboles muestreados, el 25% fue descartado, mientras que los restantes se utilizaron para reconstruir un árbol de consenso con la regla de la mayoría del 50% y para estimar los valores de probabilidad posterior (PP) de las ramas. Los árboles generados a partir de los análisis se visualizaron en el programa FigTree v.1.4.2. (http://tree. bio.ed.ac.uk/software/figtree/) y se editaron en CorelDRAW® 2018.
RESULTADOS
Análisis filogenético
La matriz incluyó 47 secuencias pertenecientes a 12 taxones clasificados dentro de la sección Globulares subsección Globulares, más el grupo externo (Oliveira et al., 2020). El alineamiento resultó en un total de 817 caracteres, de los cuales 533 eran sitios conservados, 267 variables y 201 parsimonioso-informativos. Los mejores modelos de sustitución fueron estimados como HKY+G, TPM1 y TIM3+G para ITS1, 5.8S e ITS2 respectivamente.
El análisis de Máxima Verosimilitud arrojó un árbol con la misma topología que la Inferencia Bayesiana, por lo que se exhibe únicamente este último con los valores de soporte de PP / BS para apoyar los respectivos nodos compatibles entre ambos (Fig. 1). Nuestra filogenia apoya que la secuencia NIV3096 es conespecífica con Marasmius magnus, con valores de soporte de PP = 1 y BS = 100 (Fig.1). Dicha especie se encuentra relacionada con otros miembros de la serie Brunneospermi dentro de la subsección Globulares.
Taxonomía
Marasmius magnus A. C. Magnago & J. S. Oliveira, Phytotaxa 266(4): 275. 2016. Tipo: Brasil, Santa Catarina, Florianopolis, Morro da Lagoa, Trilha do Jipe, growing on decomposing leaf litter in Atlantic Forest, 20/III/2014, A. C. Magnago 1001 (FLOR 5563). Figs. 2-3.
Píleo 20-60 mm de diám., convexo a umbonado, campanulado cuando joven, superficie seca, glabra o finamente aterciopelada, levemente estriada, marrón rojizo (8E8 a 8E5) en el centro, con estrías rojo pastel (8A4) a rojo grisáceo (8C6), las cuales se observan claramente en especímenes jóvenes, especímenes sobremaduros generalmente uniformemente coloreados con sectores más oscuros, marrón oscuro (8F4 a 8F7); margen entero, levemente ondulado, recto a levemente recurvado, formando una característica línea marginal blanca (1A1) la cual se va perdiendo en la madurez (Fig. 2). Contexto delgado, hasta 3 mm de espesor, blanquecino (1A1), membranáceo. Olor y sabor indistintos. Laminillas libres a anexas, no collariadas, distantes, blancas (1A1), volviéndose blanco amarillentas (1A2) en especímenes sobremaduros, ventricosas, hasta 6 mm de espesor, margen entero, concoloro, 20-21 laminillas por basidioma con 1-2 (-3) lamélulas entre laminillas, sin intervenosas. Estípite 30-75 × 6-8 mm, central, cilíndrico, recto, hueco, robusto, de consistencia cartilaginosa, blanco (1A1), volviéndose grisáceo (5B1) a anaranjado grisáceo (5B2), en la madurez castaño amarillento (4A2 a 4C3), superficie glabra a fibrilosa, seca, con tomento basal blanquecino (1A1). Anillo y volva ausentes. Esporada blanca (1A1).
Basidiosporas 6,8-8 × 2,5-4 µm, x = 6,9 × 3,3 µm, Q=2-2,4, Qx= 2,1, n= 25, N=2, oblongas a subcilíndricas, con una leve depresión suprahilar, hialinas, lisas, inamiloides, de paredes delgadas. Basidios 28-35 × 4-6 μm, claviformes, 4-esporados, de paredes delgadas, lisas, hialinas, inamiloides. Basidiolas 24- 32 × 4-7 μm claviformes, lisas, hialinas, de paredes delgadas, inamiloides, abundantes. Pleurocistidios 35-48 × 4-6 µm, claviformes a cilíndrico-clavado, con el ápice obtuso, hialinos, lisos, inamiloides, de paredes delgadas. Queilocistidios ausentes. Trama himenoforal fuertemente dextrinoide, subregular, compuesta de hifas entrelazadas, cilíndricas, hasta 12 μm de diám., lisas, hialinas, de paredes delgadas. Pileipellis himeniforme, compuesta por “broom-cells” del tipo Siccus, cuerpo principal 10-22 × 5-11 μm, de paredes levemente engrosadas, hialinas, con espinas apicales erectas, cortas a elongadas, 5-20 × 1-2.5 µm, cilíndricas, filiformes, simples, de paredes engrosadas, abundantes, méleas. Estipitipellis formada por hifas de hasta 11 µm de diám., paralelas, elongadas, dextrinoides, de paredes levemente engrosadas, méleas. Caulocistidios 18-24 × 4-6 μm, cilíndricos a lageniformes, ocasionalemnte 2-lobulados, dispersos y poco abundantes. Fíbulas presentes.
Distribución y hábitat. Conocido únicamente para Brasil, para los estados de Santa Catarina y Rio Grande do Sul (Magnago et al., 2016). El presente es el primer registro para la República Argentina (Fig. 4). Los especímenes conocidos hasta el momento presentan basidiomas gimnopoides, gregarios, creciendo sobre hojarasca y pequeñas ramas en descomposición de dicotiledóneas no identificadas (Fig. 2).
DISCUSIÓN
Marasmius magnus se caracteriza por sus basidiomas grandes que pueden superar los 100 mm de diám., la coloración del píleo rojiza amarronada hacia el centro, con tonalidades anaranjadas hacia el margen, finalizando en una línea marginal blanquecina, sus basidiosporas oblongas a subcilíndricas, relativamente cortas, y laminillas distantes cuyo margen presenta elementos fértiles, sin queilocistidios. Los materiales analizados difieren en algunos caracteres con el material tipo descripto por Magnago et al. (2016). El tamaño del píleo no supera los 60 mm de diám., mientras que se describe especímenes de hasta 120 mm en la descripción original; la coloración es más oscura, con predominancia de tonos marrón rojizos a rojizos grisáceos, en vez de los tonos anaranjados predominantes descriptos originalmente, además de observarse pleurocistidios más chicos (hasta 50 μm long.), mientras que lo describen de hasta 87 μm long. en el material tipo. Sin embargo, la mayoría de las características morfológicas (ej. habito gimnopoide, estípite robusto fibriloso, margen del píleo blanquecino, número, distanciamiento y coloración de laminillas, tamaño de las basidiosporas) conllevan al concepto de M. magnus.
Las diferencias encontradas probablemente se deben al análisis de especímenes en diferentes estados de desarrollo, o quizás porque los mismos presentan una mayor variabilidad fenotípica que los especímenes analizados en la descripción original.
Filogenéticamente, el espécimen argentino es conespecífico con los materiales descriptos para Brasil según las regiones analizadas (ITS1, 5.8s e ITS2), constituyendo un clado bien soportado (PP = 1 y BS = 100) (Fig. 1). A su vez, M. magnus se relaciona con M. brunneospermus Har. Takah., M. fusicystidiosus Antonín, Ryoo & D. H. Shin, M. macrocystidiosus Kiyashko & E. F. Malysheva y M. albimyceliosus Corner, conformando la serie Brunneospermi (Oliveira et al., 2020). Si bien, todas estas especies comparten caracteres morfológicos similares, como basidiomas relativamente grandes, robustos, con estípites cilíndricos, laminillas anchas y esporas relativamente pequeñas, M. magnus representa la excepción en relación a la estructura de la pileipellis, siendo la única especie de la serie con “broom-cells”, mientras que las otras especies presentan células globosas lisas (Oliveira et al., 2020), características de la sección Globulares s.str. Singer (1986).
Por otro lado, M. magnus presenta similitudes morfológicas con otras especies de la tribu Psedocorrugatus (serie Haematocephalii), como ser basidiomas relativamente grandes, con coloraciones marrón rojiza a anaranjadas, estípite cilíndrico, robusto, fibroso, esporas oblongas a subcilíndricas que no superan los 13 µm de long., y presencia de pleurocistidios poco desarrollados que no sobrepasan el himenio (Singer, 1976; Magnago et al., 2016).
De estas, M. spegazzinii (Kuntze) Sacc. & P. Syd., es una especie de amplia distribución, que convive en el mismo sitio de estudio, y es probablemente confundida con M. magnus. Ambas especies pueden diferenciarse porque M. spegazzinii presenta laminillas próximas, estípite más delgado, basidiosporas más largas (7,3-11 × 2,3-4,1 µm) y queilocistidios con forma de “broom-cells” (Singer, 1976). Estas diferencias también son válidas para otras especies similares como M. aztecus Singer, especie conocida de México (Singer, 1976) y M. floridanus Murrill conocida para el este de Estados Unidos (Desjardin, 1991).
Al observarse especímenes de M. magnus con coloraciones más oscuras, rojizas amarronadas, también podría confundirse con otras especies como M. yarizae Singer, M. hylaeae Singer y M. pseudocorrugatus Singer, las cuales presentan basidiomas relativamente grandes (aprox. 30 mm diám.) con laminillas distantes (Singer, 1976), al igual que los materiales aquí estudiados. Sin embargo, estas especies se diferencian por la ausencia de una línea marginal blanquecina en la superficie del píleo, tener esporas más grandes, en el rango de 8-11 µm de long., y presentar queilocistidios en forma de “broom-cells” (Singer, 1976).
Marasmius buzungulo Singer, descripta para África tropical, es otra especie que presenta ciertas similitudes con M. magnus como basidiomas relativamente grandes, con coloraciones amarronadas rojizas (más similar a los especímenes argentinos), esporas pequeñas y arista lamelar con queilocistidios muy dispersos (Antonín, 2007), pero se diferencia por sus laminillas apretadas, pileipellis formada por elementos lisos entremezclados con “broom- cells” y sus esporas más pequeñas (4,5-6,5 × 2,7-3,5 µm).
Material Examinado
ARGENTINA, Misiones: Dpto. Cainguás, Parque Provincial Salto Encantado, 27°03’39” S, 54°49’36,5” O, 430 m s.m., 02-V-2015, N. Ramirez SE 3-7 (CTES). Dpto. San Pedro, Parque Provincial Saltos del Moconá, 27°09’02” S, 53°54’05” O, 334 m s.m., 26-III- 2017, N. Niveiro 3096 (CTES).