Introducción
Trichloris crinita (Lag.) Parodi (Chloridoideae, Poaceae) es una gramínea nativa perenne, distribuida naturalmente de forma disyunta en regiones áridas y semiáridas de Sud y Norteamérica (Peterson et al., 2007). En ambos subcontinentes, la especie es promovida en planes de restauración de ambientes degradados (Kozub et al., 2018; USDA-NRCS, 2007). En zonas áridas y semiáridas de Argentina, debido a su tolerancia a la sequía y su aptitud forrajera, es una especie recomendada para la restauración de campos ganaderos impactados por sobrepastoreo (Blanco et al., 2013; Quiroga et al., 2009). Estudios previos han evaluado la biología reproductiva en poblaciones argentinas de la especie (Gutiérrez et al., 2016; Kozub et al., 2017), diversidad genética (Cavagnaro et al., 2006) y de caracteres adaptativos (Greco y Cavagnaro, 2003; Marinoni et al., 2018; Quiroga et al., 2010; Zabala et al., 2011) y productivos (Gil Báez et al., 2015; Greco y Cavagnaro, 2005).
Uno de los aspectos básicos en la ecología de poblaciones de plantas nativas es conocer si existe variabilidad intraespecífica en el nivel de ploidía (Lučanová, 2019). Recientemente, diferentes estudios citogenéticos combinando análisis de citogenética clásica y molecular realizados en 20 poblaciones argentinas de T. crinita han demostrado que las mismas presentan igual nivel de ploidía 2n = 4x = 40 (Kozub et al., 2019). No obstante, variaciones intraespecíficas en el nivel de ploidía han sido reportadas en la subfamilia Chloridoideae (De Silva y Snaydon, 1995; Nakagawa et al., 1987). En general, estas variaciones son de suma importancia en estudios de restauración ya que podrían traer aparejada la adaptación a diferentes condiciones ambientales (Husband et al., 2013; Lučanová, 2019). En este sentido, un trabajo previo ha demostrado que las poblaciones de T. crinita de Sudamérica tienden a distribuirse en ambientes menos áridos y calientes que las poblaciones de Norteamérica (en promedio, +200 mm de precipitación anual y -1,5°C de temperatura media anual, Quiroga et al., 2018). Teniendo en cuenta lo mencionado y al no encontrar registros en los niveles de ploidía para las poblaciones de Norteamérica, surge la inquietud de conocer si poblaciones de áreas geográficas disyuntas que abarcan climas diferentes presentan, a su vez, niveles de ploidía diferentes.
Una alternativa disponible para realizar estudios taxonómicos es la citometría de flujo (CMF) (Lysák y Doležel, 1998; Marie y Brown, 1993). La técnica permite cuantificar el contenido de ADN nuclear de una planta (valor 2C) y a partir de ello inferir el nivel de ploidía (Dolezěl et al., 2007; Greilhuber et al., 2005). Una de las principales ventajas de la CMF, con respecto al método clásico, es que no necesita células en división del material vegetal (Doležel et al., 2007). Además, los protocolos utilizados son sencillos y rápidos, lo que permite el análisis de numerosas muestras por día (Loureiro et al., 2006; Otto, 1990). La interpretación de los resultados, en términos de ploidía, se realiza a partir del estudio del contenido de ADN nuclear (valor 2C) obtenido del análisis conjunto de la muestra incógnita con un estándar de referencia (Galbraith et al., 2002). Cuando el nivel de ploidía es inferido sólo mediante CMF, los resultados deben distinguirse de los estudios cariológicos, por lo cual se utiliza el termino ploidía del ADN (ADN-ploidía; Suda et al., 2006).
Los objetivos del presente trabajo fueron: i) desarrollar un protocolo para cuantificar el contenido de ADN nuclear y ii) comparar el nivel de ploidía del ADN en diferentes poblaciones de T. crinita provenientes de Sudamérica y Norteamérica.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se evaluaron poblaciones existentes en la colección de T. crinita de INTA EEA Catamarca. Esta colección cuenta con materiales provenientes de 22 poblaciones naturales de la especie, 15 de Sudamérica y 7 de Norteamérica (Tabla 1).
Análisis por citometría de flujo
Los análisis por CMF se realizaron a partir de hojas frescas. Las muestras se procesaron utilizando el protocolo de Doležel et al. (2007) con pequeñas modificaciones. Segmentos de hojas de 4 - 6 cm2 de T. crinita y del estándar de referencia [Glycine max cv. Polanka (2n = 40, 2C = 2,5 pg ADN)] (Doležel et al., 1994) fueron picados en forma conjunta en 1 ml de solución tampón Otto I (0,1 M ácido cítrico monohidratado, 0,5% Tween 20) (Otto, 1990). Luego de filtrar las muestras por una malla de 30 µm, se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos y el sobrenadante fue eliminado teniendo la precaución de dejar 100 µl en cada tubo de 1,5 ml. Las muestras se resuspendieron en 100 µl de solución tampón Otto I con agitación suave y se incubaron en cámara fría (4°C) durante 24h. Posteriormente, se agregó 1 ml de solución tampón Otto II (0,4 M Na2HPO4 .12H2O), 50 µg/ml de ioduro de propidio (IP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 50 µg/ml de ARNasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El IP y la ARNasa se utilizaron para marcar el ADN nuclear y evitar fluorescencia del ARN de doble cadena, respectivamente. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, para luego ser corridas en un BD Accuri™ C6 (BD Biosciences, San Jose, California, USA). Los histogramas de intensidad de fluorescencia relativa (FR) fueron evaluados con el programa BD Accuri™ C6. Los núcleos obtenidos en los histogramas de FR en la fase lineal fueron encerrados en una región y ambos picos G0/G1 del estándar y de la muestra, fueron evaluados. Se analizaron de 2 a 3 individuos de cada población. El contenido de ADN nuclear relativo de las plantas se expresó mediante un índice de fluorescencia (IF) teniendo en cuenta al estándar de referencia (IF = 2C T. crinita/2C G. max). El tamaño del genoma de cada individuo, expresado en picogramos (pg), fue estimado multiplicando los valores de IF por 2,5 (contenido de ADN nuclear de G. max).
Análisis estadístico
Los datos de contenido de ADN nuclear (2C) se analizaron mediante análisis de varianza (α=0,05), considerando al subcontinente de origen como factor de efecto fijo y a las poblaciones anidadas dentro de cada subcontinente como factor de efecto aleatorio. Se usó el software estadístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2012).
Resultados
El histograma de intensidad de fluorescencia relativa (FR) de T. crinita analizado en conjunto con G. max como estándar de referencia mostró cuatro picos, dos representando el contenido relativo de ADN nuclear de T. crinita y los otros dos de G. max (Figura 1). Los picos dominantes corresponden a los núcleos en la fase G0/G1 (contenido de ADN nuclear, 2C), mientras que los picos menores corresponden a los núcleos en la fase G2 del ciclo celular (contenido de ADN nuclear, 4C). La ausencia de solapamiento de los picos generados indica que el estándar interno fue adecuado.
En general, se observó escasa variación entre poblaciones en el índice de fluorescencia (IF, 0,76 - 0,81) y contenido de ADN nuclear (2C, 1,90 - 2,01 pg; Tabla 1). En ese sentido, no se encontraron diferencias significativas de contenido de ADN nuclear entre poblaciones de Sudamérica y Norteamérica (P= 0,955, promedio en ambos subcontinentes = 1,97 pg), y tampoco entre poblaciones dentro de cada subcontinente (P= 0,097; Tabla 1).
Discusión
Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que todas las poblaciones evaluadas de T. crinita, tanto de Sudamérica como de Norteamérica, presentan similar contenido de ADN nuclear (2C entre 1,95 - 2,01 pg), lo que sugiere la misma ploidía del ADN (Suda et al., 2006). La uniformidad que encontramos es consistente con evaluaciones realizadas sobre otras 20 poblaciones de T. crinita originarias del centro-oeste de Argentina, donde todas presentaron el mismo nivel de ploidía (2n = 4x = 40) (Kozub et al., 2019). Cabe destacar, que en el presente trabajo ampliamos la evaluación hacia poblaciones del sector disyunto norte de la distribución de la especie. Hasta la fecha no existía un estudio comparativo de este tipo entre poblaciones de ambos subcontinentes.
Considerando que como se dijo, T. crinita habita en Norteamérica y Sudamérica, en ambientes con ciertas diferencias climáticas (Quiroga et al., 2018), nuestros resultados contrastan con lo hallado por Hunter et al. (2001) y por De Silva y Snaydon (1995) en otras especies. Hunter et al. (2001) observaron en Larrea tridentata variación en el nivel de ploidía asociadas a las restricciones ambientales de los sitios habitados por la especie: poblaciones diploides tendían a predominar en ambientes relativamente más benignos (desierto de Chihuahua), mientras que poblaciones con mayores niveles de ploidía tendían a predominar a niveles crecientes de restricción ambiental (tetraploides en el desierto de Sonora, hexaploides en el desierto de Mojave). Por su parte, De Silva y Sandon (1995) encontraron que poblaciones tretraploides de Cynodon dactilon predominaban en ambientes con suelos de pH neutro (> 6,5) mientras que poblaciones diploides lo hacían en suelos de pH ácido (< 5). Cabe aclarar que si bien variaciones intraespecíficas en el nivel de ploidía traen por lo general aparejadas adaptaciones diferenciales en las plantas (Lučanová, 2019), no ocurre siempre lo mismo en sentido inverso: que poblaciones adaptadas a diferentes ambientes tengan necesariamente distinto nivel de ploidía. Esto porque las adaptaciones de distintos genotipos o poblaciones dentro de una especie pueden deberse a cambios genéticos ocurridos a otros niveles jerárquicos, sin que ocurra cambio de nivel de ploidía (Husband et al., 2013). De hecho, nuestros resultados que muestran niveles de ploidía uniformes entre poblaciones de T. crinita parecen no ser una excepción, dado que Wood et al. (2009) reportaron que sólo el 12-13% de las especies de plantas angiospermas evaluadas presentan variación intraespecífica en el nivel de ploidía.
Desde el punto de vista aplicado, que no se hayan detectado variaciones en el nivel de ploidía entre poblaciones de una misma región, o de ambas regiones de su distribución disyunta (Sudamérica, Norteamérica), sumado al hecho de que la especie ha sido definida como autocompatible y autógama (Gutiérrez et al., 2016; Kozub et al., 2017), brinda un panorama amplio de posibilidades de uso del germoplasma en planes de restauración (Kramer et al., 2018). Por ejemplo, para introducir materiales donde la presencia de la especie ha sido fuertemente diezmada, o utilizar mezclas de materiales de distintos orígenes para aminorar el efecto de variaciones climáticas e incrementar el potencial evolutivo (Broadhurst et al., 2008). Sin embargo, a pesar de tener el mismo nivel de ploidía, estudios poblacionales de T. crinita en Sudamérica mostraron variación en marcadores neutrales de AFLPs que a su vez se correlacionaron con características de importancia agronómica (Cavagnaro et al., 2006). Por lo tanto, integrar información de distintos marcadores de base genética podría aportar a orientar medidas de manejo, conservación y restauración.
Conclusiones
No se encontraron diferencias en el contenido de ADN nuclear entre poblaciones de Trichloris crinita de Sudamérica y Norteamérica, tampoco entre poblaciones dentro de cada subcontinente. Los resultados sugieren que las poblaciones evaluadas presentan el mismo nivel de ploidía. Los resultados obtenidos en el presente estudio proporcionan datos de referencia sobre el contenido de ADN nuclear de T. crinita en Sudamérica y Norteamérica, y generan una plataforma para futuros trabajos de CMF. Se considera importante poder realizar análisis complementarios mediante técnicas citogenéticas que permitan profundizar sobre la naturaleza poliploide de T. crinita.