La Paleoparasitología es la disciplina que estudia el origen y la evolución de los parásitos en materiales antiguos, tanto de origen arqueológico como paleontológico (Araújo, Reinhard, Ferreira, Pucu y Chieffie, 2013). Las técnicas paleoparasitológicas han permitido detectar infestaciones y, en ocasiones, diagnosticar enfermedades en poblaciones del pasado. Los materiales de estudio incluyen coprolitos, sedimentos asociados a la cavidad pélvica de esqueletos, así como de letrinas, basureros y otros espacios en sitios arqueológicos y, en menor medida, tejidos momificados y bolos de regurgitación de aves rapaces (Fugassa, 2014). Dado a que algunas especies de parásitos necesitan condiciones ambientales específicas para completar sus ciclos biológicos, el hallazgo de restos parasitarios como larvas, huevos y quistes en muestras antiguas permite estimar los escenarios paleoambientales y paleoclimáticos en los que las poblaciones vivieron (Le Bailly et al., 2006), así como los patrones de movilidad o migraciones en el pasado (Araújo, Reinhard, Ferreira y Gardner, 2008). También es posible hacer inferencias sobre la dieta, el estado de salud y las prácticas culturales de grupos humanos antiguos (Yeh, Prag, Clamer, Humbert y Mitchell, 2015).
En Argentina, esta disciplina tuvo un gran desarrollo en los últimos quince años principalmente en Patagonia, pudiendo confirmar la presencia de parasitosis en poblaciones humanas desde la transición Pleistoceno-Holoceno (Araújo et al., 2015; Fugassa, 2006; Fugassa, Beltrame, Sardella, Civalero y Aschero, 2010; Fugassa y Petrigh, 2019; Fugassa, Petrigh, Fernández, Carballido Catalayud y Belleli, 2018; Fugassa, Sardella, Guichón, Denegri y Araújo, 2008). Asimismo, el hallazgo de parásitos en coprolitos de animales y bolos de regurgitación de aves permitió conocer una gran diversidad de especies presentes en el pasado y el riesgo de zoonosis que esto habría implicado para los grupos humanos relacionados (Beltrame, Pruzzo, Sanabria, Pérez y Mora, 2020; Beltrame, Vieira de Souza, Araújo y Sardella, 2014; Tietze, Barberena y Beltrame, 2019).
En la región central de Argentina se han desarrollado líneas de investigación desde una perspectiva bioarqueológica, centradas en las formas de vida de las poblaciones humanas que habitaron los diferentes ambientes ecológicos del actual territorio de Córdoba. Estos estudios han revelado persistencias y cambios en el estilo de vida de estas poblaciones durante los últimos 4500 años, específicamente cambios en la frecuencia de algunas patologías y actividades físicas realizadas (Salega y Fabra, 2013), en las estrategias de subsistencia (Fabra y González, 2019; Laguens, Fabra, Dos Santos y Demarchi, 2009; Tavarone, Colobig y Fabra, 2019), y en la estructura biológica y la historia evolutiva de las poblaciones (Fabra y Demarchi, 2013; Nores, Fabra, García y Demarchi, 2017). Sin embargo, hasta la fecha no se habían realizado estudios que permitieran detectar la presencia de parásitos en poblaciones arqueológicas de la región.
En este marco, el objetivo de este trabajo es presentar los resultados de los primeros análisis paleoparasitológicos realizados en individuos de cuatro sitios arqueológicos de la Provincia de Córdoba, fechados en el Holoceno tardío, entre 2562 ± 47 y 533 ± 57 14C años AP. Se ha considerado que el nucleamiento social, el crecimiento poblacional y la reducción de la movilidad residencial asociados a las prácticas horticultoras tuvieron lugar alrededor de 1500-1200 años AP. Se propone como hipótesis, que estos procesos, así como la proximidad y la ingesta de ciertos animales silvestres, habrían favorecido el aumento de patologías de origen infeccioso causadas por parásitos. Así, es de esperar la presencia de parásitos gastrointestinales en poblaciones humanas hacia finales del Holoceno tardío.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios arqueológicos
Trece individuos procedentes de cuatro sitios arqueológicos ubicados en dos regiones de la Provincia de Córdoba fueron estudiados: el sitio El Diquecito en las Llanuras, y los sitios El Vado, Guasmara y Loteo 5 en las Sierras Centrales (Fig. 1, Tabla 1). El Diquecito se encuentra en la costa sudoeste de la Laguna Mar Chiquita, en el noreste de la provincia. Es un sitio al aire libre altamente visible, de aproximadamente 500m de largo por 500 de ancho. Once individuos juveniles y un adulto fueron recuperados, de los cuales sólo nueve contenían sedimentos abdominales, fechados mediante AMS entre 2562 ± 47 y 500 ± 57 14C años AP (Fabra, González y Salega, 2012). El Vado es un sitio a cielo abierto ubicado en el Departamento Punilla, en el cañón del río Santa Catalina, donde aparecieron restos humanos pertenecientes a un único individuo, datado por AMS en 2156 ± 86 14C años BP (Fabra y Demarchi, 2013). Loteo 5 también es un sitio a cielo abierto, excavado en 2011. Se encuentra ubicado en una propiedad privada en la ciudad de Santa Rosa de Calamuchita, donde se halló un entierro primario doble, con cerámicas, cáscaras de huevos, y caracoles asociados. El individuo 1 fue datado en 533 ± 42 14C años AP (Fabra y González, 2019). Finalmente, el sitio Guasmara fue excavado en 1998. Se encuentra ubicado en la localidad Villa de las Rosas, Departamento San Javier, en una barranca dentro de un campo privado. A pesar de que se hallaron restos pertenecientes a dos individuos, sólo uno contenía sedimentos abdominales (individuo 1). El individuo 2 fue fechado por AMS en 920 ± 20 14C años AP (Laguens et al., 2009) (Fig. 2).
Región | Sitio Arqueológico | Individuo | Sexo | Edad | Datación radiocarbónica (código de fechado) | Origen de las muestras |
Llanuras | El Diquecito | CRI1 | F | 42-87 | 2562±47 (AA93742) | CP |
CQI1 | M | 45 | 2400±47 (AA93740) | FS | ||
CP | ||||||
CSI1 | M | 33-42 | 2331±46 (AA93745) | FS | ||
CGI1 | F | 33-46 | 1872±59 (MTC14023) | FS | ||
CP | ||||||
CEI1 | M | 42-49 | 1192±140 (MTC13247) | FS | ||
CP | ||||||
CLI1 | M | 33-42 | 937±150 (MTC13214) | CP | ||
CBI1 | M | 20-23 | 750±85 (MTC12807) | FS | ||
CP | ||||||
CAI1 | F | 33-46 | 698±42 (AA93743) | FS | ||
CP | ||||||
CMI1 | F | 42-87 | 500±57 (MTC14022) | FS | ||
CP | ||||||
Sierras Centrales | El Vado | EVI1 | F | 30-44 | 2156±86 (MTC12808) | FS |
Guasmara | GI1 | M | 20-24 | 920±20 (UCI 22281) (Por asociación con Individuo 2) | FS | |
Loteo 5 | L5I1 | F | 35-50 | 533±42 (AA102659) | FS | |
L5I2 | F | 43-71 | 533±42 (AA102659) (Por asociación con Individuo 1) | S-CA |
Individuo: CRI1, sitio El Diquecito, cuadricula R, individuo 1; CQI1: Sitio El Diquecito, Cuadricula Q, individuo 1; CSI1: sitio El Diquecito, cuadricula S, individuo 1; CGI1: sitio El Diquecito, cuadricula G, individuo 1; CEL1: sitio El Diquecito, cuadricula E individuo 1; CLI1: sitio El Diquecito, cuadricula L, individuo 1; CBI1: sitio El Diquecito, cuadricula B, individuo 1; CAI1: sitio El Diquecito, cuadricula A, individuo 1; CMI1: sitio El Diquecito, cuadricula M individuo 1; EVI1: sitio El Vado individuo 1: GI1: sitio Guasmara individuo 1; L5I1: sitio Loteo 5 Santa Rosa de Calamuchita, individuo 1; L5I2: sitio Loteo 5 Santa Rosa de Calamuchita, individuo 2; Sexo: F: Femenino, M: Masculino, Laboratorio donde se realizó el fechado radiocarbonico: AA: Universidad de Arizona, MTC: Universidad de Tokio, UCI: Universidad de Irving; Origen de las muestras: cavidad pélvica, FS: forámenes del sacro, CA: cavidad abdominal, S: sacro
Se analizaron muestras de sedimentos (n=20), principalmente de la cavidad pélvica de los individuos, pero también de la cavidad abdominal y la superficie del sacro, tomados durante el trabajo de campo. Sedimentos de los forámenes del sacro, extraídos en el laboratorio después de la limpieza de los restos, también fueron procesados (Tabla 1). Además, se analizaron muestras control del sitio, consistentes en sedimentos del cráneo de los individuos, para descartar una posible contaminación ambiental.
Metodología
Se rehidrataron 5g de sedimento de cada muestra, incluidos los controles en una solución de fosfato trisódico al 0,5% (Callen y Cameron, 1960) durante 72h a 4°C. Con el objetivo de obtener la mayor cantidad de hallazgos posibles, se aplicaron tres técnicas de concentración basadas en distintos principios: sedimentación espontánea (Lutz, 1919), disgregación en ácido clorhídrico al 10% (Reinhard, Araújo, Sianto, Costell y Swope, 2008 con modificaciones) y flotación en solución de sacarosa (δ=1290) (Sheather, 1923). Se separaron alícuotas de 200μL con las dos primeras técnicas, mientras que se observó un único preparado con la flotación en sacarosa después de media hora. Los preparados fueron observados con un microscopio óptico trinocular (Labklass XSZ 107 CCD) con 100X (aumentos totales), y los restos parasitarios fueron fotografiados con 400X y medidos con el software IS Capture versión 3.5.9. El diagnóstico de los parásitos fue hecho en base a sus características morfológicas y morfométricas (Atías, 1998; Rey, 2008).
RESULTADOS
Se detectó la presencia de estructuras sugestivas de huevos o larvas de nemátodos en los cuatro sitios arqueológicos estudiados durante los análisis paleoparasitológicos (Tabla 2). En general, los restos se encontraron con deformaciones, daños o con detritus adherido, lo cual obstaculizó el diagnóstico diferencial. Los restos fueron recuperados mediante las técnicas de sedimentación espontánea y disgregación en ácido clorhídrico. La flotación en solución de sacarosa no evidenció resultados positivos. En todos los casos, se hallaron escasos restos parasitarios, que no pudieron ser identificados al nivel taxonómico de género o especie. Al contrario, una gran cantidad de esporas de hongos, granos de polen y otros microrestos no identificados fueron observados.
Sitio | Individuo | Resultado Paleoparasitológico | Medidas de Estructuras Parasitarias | |
Largo | Ancho | |||
El Diquecito | CRI1 | Negativo | - | - |
CQI1 | Negativo | - | - | |
CSI1 | Negativo | - | - | |
CGI1 | Negativo | - | - | |
CEI1 | Negativo | - | - | |
CLI1 | Negativo | - | - | |
CBI1 | Negativo | - | - | |
CAI1 | Huevo de Heterakoidea | 66 µm | 57 µm | |
CMI1 | Huevo de Heterakoidea | 77.33 µm | 61.81 µm | |
El Vado | EVI1 | Sugestivo de huevo de Heterakoidea | 44.89 µm | 48.17 µm |
Guasmara | GI1 | Larva de nematodo NI | 560.76 µm | 18.17 µm |
Sugestivo de huevo de nematodo NI | 51.31 µm | 36.81 µm | ||
Sugestivo de huevo de Ascaridoidea | 65.29 µm | 40.10 µm | ||
Loteo 5 | L5I1 | Larva de nematodo NI | - | - |
L5I2 | Huevo de nematodo NI | 55.88 µm | 44.17 µm |
Individuo: CRI1, sitio El Diquecito, cuadricula R, individuo 1; CQI1: Sitio El Diquecito, Cuadricula Q, individuo 1; CSI1: sitio El Diquecito, cuadricula S, individuo 1; CGI1: sitio El Diquecito, cuadricula G, individuo 1; CEL1: sitio El Diquecito, cuadricula E individuo 1; CLI1: sitio El Diquecito, cuadricula L, individuo 1; CBI1: sitio El Diquecito, cuadricula B, individuo 1; CAI1: sitio El Diquecito, cuadricula A, individuo 1; CMI1: sitiio El Diquecito, cuadricula M individuo 1; EVI1: sitio El Vado individuo 1: GI1: sitio Guasmara individuo 1; L5I1: sitio Loteo 5 Santa Rosa de Calamuchita, individuo 1; L5I2: sitio Loteo 5 Santa Rosa de Calamuchita, individuo 2: Resultado paleoparasitologico: NI: No identificado; Unidad de medida: µm: micrón
En el individuo del sitio Guasmara, una estructura similar a un huevo de nematodo no identificado (51.31μm x 36.81μm) (Fig. 3A) con pared doble y parcialmente dañada fue observada. Además, se halló una estructura que sugiere un huevo de Ascaridoidea (65.29μm x 40.10μm), de color pardo, forma elongada y cobertura mamelonada, típica de los ascarídidos (Fig. 3B). Finalmente, se halló una larva de nematodo (560.76μm x 18.17μm) (Fig. 4A-C), posiblemente de vida libre, por lo que no consideramos a este hallazgo como un resultado positivo de infestación parasitaria.
En el individuo estudiado del sitio El Vado fue identificado un huevo sugestivo de Heterakoidea, que midió 44.89μm x 48.17μm (Fig. 3C). Un individuo del sitio Loteo 5 (L5I2) evidenció la presencia de una estructura de huevo de nematodo no identificado con una pared doble y medidas de 55.88μm x 44.17μm (Fig. 3D). En el otro individuo analizado de este sitio (L5I1) se observó una larva de helminto no identificada, la cual se encontraba enroscada, impidiendo su medición (Fig. 4D). Todas las muestras control arrojaron resultados negativos para estos sitios.
Uno de los nueve individuos (CMI1) estudiados del sitio El Diquecito reveló la presencia de un huevo de Heterakoidea (73.33μm x 81.81μm) con forma ligeramente ovoide y contenido amorfo (Fig. 3E). La muestra control no evidenció contaminación ambiental. En el individuo CAI1, donde no se hallaron restos parasitarios en la cavidad pélvica, se identificó un huevo de Heterakoidea de doble pared (66μm x 57μm) en la muestra control tomada del cráneo (Fig. 3F).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El hallazgo de estructuras parasitarias en el presente trabajo confirma que las poblaciones que vivieron en las diferentes regiones de la Provincia de Córdoba, principalmente en las Sierras Centrales, estuvieron expuestas a parásitos en el pasado. Desde una perspectiva ecológica, el parasitismo se presenta como un fenómeno natural complejo compuesto por parásito-huésped-ambiente, un sistema donde cada elemento interactúa e influye necesariamente con el otro (Ferreira, 1973). Las parasitosis pueden incluir casos de parasitismo verdadero o parasitismo falso o accidental, así como también de zoonosis parasitaria. En los eventos de falso parasitismo, el ser humano no es el huésped definitivo del parásito, por lo que no puede completar su ciclo en su organismo y es eliminado en sus heces. Generalmente, los casos de falso parasitismo en humanos se producen por la ingesta de partes de animales que son los huéspedes definitivos del parásito. Estos eventos han sido reportados como el resultado de la presencia de parásitos animales en restos humanos provenientes de sitios arqueológicos de todo el mundo (Le Bailly, 2005; Reinhard, 1990; Sianto et al., 2009; Vieira et al., 2018). Respecto a los casos de zoonosis parasitarias, los parásitos animales tienen éxito en establecerse en el cuerpo humano, completando parcial o totalmente su ciclo, causando manifestaciones clínicas (Sianto et al., 2009). Todos estos eventos pueden ser entendidos como interacciones ecológicas y la Paleoparasitología tiene el potencial de identificar estas interacciones en escenarios temporales.
Los parásitos hallados en este trabajo infestan a un amplio espectro de animales, incluyendo aves y roedores (Chabaud, 1974; Hartwich, 1974; Kijewska, Rokicki, Sitko y Wegrzyn, 2002), pero no han sido reconocidos como agentes causales de infestación verdadera en el hombre. En principio, con el hallazgo en el individuo del sitio Guasmara de una estructura sugestiva de un huevo de Ascaridoidea, superfamilia que incluye Ascaris sp., parásito del ser humano, no se podría descartar una genuina infección humana. Sin embargo, por la poca especificidad taxonómica se considera a este hallazgo como posible ascarídido de otros animales. Así, se sugiere que eventos de falso parasitismo podrían haber tenido lugar en estas poblaciones humanas. El registro zooarqueológico confirma la presencia de roedores y aves en algunos sitios arqueológicos de la provincia. Particularmente para las Sierras Centrales durante el Holoceno tardío, se ha propuesto la sustitución de la caza de grandes presas como el guanaco (Lama guanicoe), y los cérvidos como el ciervo de las pampas (Ozotoceros bezoarticus), por pequeños animales, incluyendo a los roedores cavidos (Caviidae) y los tucutucu (Ctemoys sp.), iguanas (Tupinambis sp.), “tinamúes” o mal llamados "perdices" (Tinamidae) (Rivero, Medina, Recalde y Pastor, 2010), y también un incremento en el consumo de aves de la familia Rheidae, patos (Anatidae), “vizcacha de las pampas” (Lagidium viscacia) y armadillos (Euphractinae) (Rivero y Medina, 2016). Puntualmente, se sugirió que la intensificación en la frecuencia de pequeños roedores en los conjuntos faunísticos desde el Holoceno Medio hasta el Tardío, fue consecuencia de un ajuste comportamental en respuesta a la disminución de L. guanicoe, debido a la sobre-explotación del ambiente por parte del humano. Además, los análisis isotópicos de δ13Ccol y δ15N en algunos individuos estudiados en este trabajo, muestran valores coincidentes con una posible ingesta de aves y roedores por estas poblaciones (Fabra y González, 2019). En suma, los datos aportados por estudios zooarqueológicos e isotópicos nos permiten sugerir una dieta basada en estos animales como una forma de contacto entre parásitos enzoóticos y humanos. Otra explicación posible está relacionada con la ingesta de alimentos contaminados con heces de animales que cohabitaron el mismo espacio que los humanos. En ambos casos, la ocurrencia de los nematodos hallados en estos individuos estaría relacionada a una mayor proximidad con los animales, huéspedes intermedios o definitivos de estos parásitos, durante el Holoceno Tardío.
Se ha reportado el hallazgo de huevos de ascarídidos en materiales antiguos, tanto de origen arqueológico en América (Araújo et al., 2015; Fugassa, 2006; Fugassa y Barbarena, 2006), como paleontológico en sitios de Europa y Sudamérica, extendiéndose su registro hasta 100 y 240 millones de años, respectivamente (Da Silva et al., 2014; Poinar y Boucot, 2006). Por otro lado, la extensión temporal de los reportes de Heterakoidea en el pasado es mucho más reciente, restringida a un basurero arqueológico en Francia (Bouchet, 1991), dos sambaquis brasileños (Camacho et al., 2013, Camacho, Borba Cruz, Silva, Mendonça de Souza y Araújo, 2015) y coprolitos de megafauna extinta del Holoceno en Nueva Zelanda (Wood et al., 2013). La identificación de huevos sugestivos de Heterakoidea en individuos de los sitios El Vado y El Diquecito es interesante, ya que sería el primer reporte paleoparasitológico de este parásito asociado directamente a los contenidos intestinales de restos humanos. La presencia de un huevo de Heterakoidea en sedimentos del cráneo del individuo CAI1 del sitio El Diquecito sugiere contaminación ambiental en este individuo, aunque no se hallaron huevos en su cavidad pélvica. La ocurrencia de estos parásitos en este individuo estaría relacionada con la presencia de animales, principalmente aves, en el sitio. Los huevos de esta Superfamilia tienen cáscara gruesa con granulación, difícil de distinguir entre las especies (Chabaud, 1978; Yevstafyeva et al., 2018), y pueden presentar cambios en sus bordes y estructura cuando se liberan al ambiente (Yevstafyeva et al., 2018). Además, la pobre preservación de material arqueológico puede resultar en la alteración de los huevos. Estos son factores limitantes para el diagnóstico preciso de las especies Heterakoidea.
Respecto al bajo número de restos hallados, consideramos que la composición de ciertos tipos de suelos puede ser un factor negativo para la preservación de parásitos. Un trabajo anterior (Ramirez, Xavier, Fabra e Iñiguez, 2017) evaluó la preservación de restos parasitarios en suelos locales a partir de la elaboración de coprolitos experimentales, es decir, materia fecal con resultados parasitológicos positivos artificialmente desecados (Iñiguez, 1998), con añadidos de sedimentos de diversos sitios arqueológicos de la provincia de Córdoba. Los resultados permitieron determinar la pérdida estadísticamente significativa de huevos de parásitos, especialmente en presencia del añadido de sedimento, cuando se comparó con muestras de materia fecal frescas, sin añadidos de suelo.
La escasez de parásitos hallados en El Diquecito posiblemente se debe también a la ubicación del sitio, parcialmente inmerso en la costa de una laguna, donde la temperatura y la humedad podrían haber permitido una importante biodegradación de los restos parasitarios. Además, los flujos y corrientes del agua generan percolación, es decir la migración de los restos hacia capas estratigráficas inferiores, un factor que se incrementa en sitios a cielo abierto (Fugassa, 2014).
Finalmente, el bajo número de estructuras halladas en todos los sitios arqueológicos difiere de los resultados para otras regiones del país, especialmente en Patagonia. Estos dos ambientes son extremadamente diferentes en términos de temperaturas, humedad y regímenes fluviales, los cuales influyen significativamente en la preservación de restos orgánicos y en la formación de coprolitos. Algunos ambientes, especialmente aquellos secos y áridos, sean fríos o cálidos, permiten una buena preservación general de muchos materiales estudiados comúnmente en Paleoparasitología, incluyendo cuerpos momificados y tejidos blandos, textiles, pellets de regurgitación y coprolitos (Ferreira, 2014). Ambientes húmedos, generalmente relacionados con regímenes fluviales intensos y alta actividad microbiana entre otros, no se caracterizan por dar lugar a una preservación ideal de estas materialidades. En la extensa región patagónica se encuentra una gran diversidad de ambientes, pero, en general, todos pueden ser descriptos como fríos y secos (Guichón, Trivi y Burry, 2014). Por el contrario, en la región central del país, los períodos de mayor humedad o sequía tienen ciclos estacionales, coincidiendo con los semestres más cálidos o más fríos del año, respectivamente (Furgioni, Salvatierra y Tuninetti, 2016). Además, estudios paleoambientales realizados sobre multi-indicadores (sedimentología, geoquímica, isótopos estables, restos biológicos) en la Laguna Mar Chiquita han permitido estimar la alternancia de periodos de mayor aridez y balance hídrico negativo, en contraposición con momentos de mayor humedad y niveles elevados de agua durante los últimos 20.000 años (Piovano, Zanor y Ariztegui, 2006), lo cual seguramente impactó no solo en la ocupacion humana efectiva de estos territorios, sino en las condiciones de preservación de los materiales arqueológicos. Debido a estas características ambientales, los coprolitos no se forman en la región central del país, dejando a los sedimentos, principalmente a los de la cavidad pélvica de esqueletos, como el único tipo de muestras para estudios paleoparasitológicos de parásitos intestinales. La diferencia en términos de preservación de las estructuras parasitarias entre sedimentos y coprolitos es importante, ya que estos últimos brindan, además de una mejor preservación, mayores posibilidades de identificación de ciertos parásitos a niveles taxonómicos precisos (Borba, Machado-Silva, Le Bailly e Iñiguez, 2019). Así, la pérdida de parásitos en las muestras analizadas en el presente trabajo podría deberse a la acción de efectos tafonómicos, tales como el calor de la desecación y la composición orgánica e inorgánica del suelo. Sin embargo, no puede descartarse que las infestaciones tuvieran una baja carga parasitaria en las poblaciones que habitaron el actual territorio de la provincia de Córdoba en el Holoceno Tardío.
En resumen, los estudios paleoparasitológicos presentados en este trabajo sugieren que las poblaciones que habitaron esta región estuvieron expuestas a parásitos, posiblemente de origen animal, al menos desde hace 2100 años AP. Los hallazgos se consideran evidencias de interacciones culturales y ecológicas entre humanos y animales, que dieron como resultado eventos de falso parasitismo. Este primer estudio paleoparasitológico en la región contribuye al conocimiento de los modos de vida de estas poblaciones en el Holoceno Tardío. La aplicación de técnicas más sensibles, como las empleadas en Paleoparasitología Molecular, será abordada a futuro, con el objetivo de alcanzar una identificación más precisa de los restos hallados, incluso en muestras con resultados negativos mediante microscopía (Iñiguez et al., 2006; Iñiguez, 2014).