Introducción

El gen Calmegin ⁴ es esencial para conferir la capacidad fecundante a los espermatozoides y se expresa en tejido testicular de mamíferos ^8,6. Ha sido estudiado en seres humanos, roedores y otras especies ^7,10 encontrando que es determinante sobre la función reproductiva, ya que sin el gen (knockoutCLGN-/), se observa que el macho llega a ser estéril ¹⁰.

Asímismo, se ha demostrado que la deficiencia de Calmegin no altera la morfología y motilidad normal de los espermatozoides, motivo por el cual se podría clasificar a los espermatozoides como aptos para fecundar, a pesar de ser estériles ³.

En alpacas, la secuencia del gen descrita en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) fue obtenida por perdigonada, encontrándose dentro del cromosoma 2 pero sin una ubicación específica y con un tamaño aproximado de 41493 bp.

Es por este motivo que, para continuar estudios en este gen, es necesario contar con cebadores específicos diseñados y validados.

Material y métodos

Para el diseño in silico de los cebadores, se empleó el software primer 3 versión 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), utilizando como base la secuencia del gen Calmegin en alpacas (Gene ID: 102536054) obtenido del GenBank del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/).

La selección de cebadores se realizó en dos fases: primero se consideraron las parejas de cebadores que cumplían con los criterios establecidos por Abdelsalam¹ y en la segunda fase, se evaluaron las características físicas de los mismos empleando el programa Oligo Analyzer 3.0 de Integrated DNA Technologies (IDT) (https:// www.idtdna. com/pages/tools/oligoanalyzer).

Por otro lado, se determinó la ubicación de los ceba­ dores diseñados con respecto a la secuencia del gen y la variante x2 de ARNm (código acceso NCBI: NW_005 882 945.1) de Calmegin mediante alineamiento, empleando el programa Clustal Omega (https://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Para la validación de los primers mediante PCR convencional, se emplearon 20 muestras de tejido testicular provenientes de alpacas beneficiadas en el camal municipal de Huancavelica (Perú).

Para la extracción del ADN se empleó el kit innuPREP DNA Mini Kit (Analytik Jena), mientras que para la amplificación se empleó el innuMIX Standard PCR MasterMix (Analytik Jena) y un protocolo de amplificación de 1 ciclo de desnaturalización inicial de 95°C por 2 min, 40 ciclos de 95°C de 40 s, 58°C de 40 s, 72°C de 40 s y, finalmente, elongación final 72°C de 10 min en un termociclador Thermal Cycler 0.2 ml x 64 PCR- 300 (mcr).

Figura 1 A: cebadores Calmegin-CG1; tamaño de amplicón CG1: 397 pb. B: cebadores Calmegin-CG2, tamaño de amplicón CG2: 321 pb. En ambos casos: carril M: marcador de peso molecular de 1 kb; carril 1-7: amplicones de muestras de alpaca y carril 8: control negativo.  

Los amplicones fueron visualizados por electroforesis horizontal en gel de agarosa.

Resultados y discusión

Mediante el empleo del programa primer 3 se obtuvieron un total de 20 pares de cebadores; sin embargo, se seleccionaron 10 pares que cumplieron con los criterios ya anteriormente mencionados¹.

Posteriormente, se evaluaron las características físicas de los mismos, seleccionándose finalmente sólo 2 pares: Calmegin-CG1 y Calmegin-CG2.

Con el objeto de determinar la zona de hibridación de estos pares de cebadores, se realizó el alineamiento de ellos con las secuencias nucleotídicas de la variante x2 de ARNm y el gen Calmegin de alpaca, determinándose que para el caso de Calmegin-CG, el forward se hibrida entre los nucleótidos 40322 y 40342 y el reverse de Calmegin-CG1 está entre los 40700 y 40720 del exón 16 en ambos casos; mientras que, en el caso de Calmegin-CG2 el forward se hibrida entre los 28252 y 28272 y el reverse entre los 28553 y 28573 del intrón 1.

El alineamiento de la secuencia de ADN y ARNm permite tener mayor confiabilidad en casos como este, que no se cuenta con suficiente información sobre la especie a investigar en la base de datos del NCBI⁹.

En el presente trabajo, al igual que Flores², se han considerado válidos los cebadores cuyos amplicones obtenidos por PCR convencional y visualizados en gel agarosa (Figura 1) coinciden con el tamaño de pares de bases obtenido in silico, siendo para Calmegin-CG1 y Calmegin-CG2, 397 pb y 321 pb respectivamente.

Este es el primer reporte de diseño y validación de cebadores específicos para la identificación del gen Calmegin en tejido testicular de alpaca. Debido a la importancia de este gen en la reproducción de otras especies^3,5,6) consideramos que es imprescindible continuar con investigaciones que empleen los hallazgos del presente estudio.