Introducción
Los suelos se encuentran entre los ecosistemas más valiosos del mundo y una de las principales amenazas que los afectan es su contaminación por metales pesados (MP) (Pepper et al., 2009; FAO & ITPS, 2015). Entre los MP que representan una grave amenaza tanto para la salud humana como para el ambiente se encuentran el Zn (zinc), Cu (cobre), Cd (cadmino) y Pb (plomo) (Weissenhorn & Leyval, 1995; WHO, 2013).
En algunas especies microbianas la adsorción de MP en la superficie o la acumulación dentro de estructuras celulares son mecanismos de importancia biotecnológica (Kumar et al, 2009; Saravanan et al, 2011) para removerlos a partir de ambientes contaminados (Essa & Mostafa, 2011).
Las algas del suelo se clasifican en: 1) algas terrestres formando costras sobre la superficie, 2) algas terrestres viviendo sobre superficies húmedas y 3) algas que viven en el perfil del suelo (Shtina & Gollerbakh, 1976; Belnap, 1993). Entre las partículas del suelo es frecuente hallar distintas especies de Cyanobacteria y algas eucarióticas pertenecientes a los grupos Chloroplastida, Euglenophyta, Chrysophyta y Rhodophyceae (Metting, 1981). Para Hoffman (1989), los organismos fotosintéticos más comunes del suelo son las Cyanobacteria, las Chloroplastida y las Bacillarophyceae, mientras que las Xantophyta, Euglenophyta y Rhodophyceae ocurren menos frecuentemente.
Las algas del suelo tienen un papel ecológico importante en los ecosistemas como colonizadores de suelos desnudos originados por incendios, actividad postvolcánica o diferentes actividades mineras (Johansen & Shubert, 2001; Lukesová, 2001). La colonización por las Cyanobacteria y las algas verdes suele cumplir un rol relevante durante la primer etapa de remediación en ambientes terrestres degradados (Lukesová & Hoffmann, 1996; Garcia-Meza et al, 2006). En un sitio contaminado las especies de algas y Cyanobacteria que crecen naturalmente pueden acumular altas concentraciones de MP (Arica et al., 2005) y responden mejor bajo estrés que aquellas introducidas de otras áreas en términos de supervivencia, crecimiento y reproducción (Yoon et al, 2006).
En los últimos años, las algas del suelo han emergido como candidatas potenciales para su aplicación en el desarrollo de un medio ambiente sustentable (Singh et al., 2016, 2017). Recientemente, las Cyanobacteria y algas eucarióticas han sido foco de estudio dada su habilidad para adsorber, secuestrar, formar complejos con MP y translocarlos a sus vacuolas (Suresh & Ravishankar, 2004), pudiendo ser utilizadas para la restauración en ambientes contaminados con MP o hidrocarburos (Salgado et al, 2006).
En Argentina, se ha abordado el problema de contaminación por MP en ecosistemas acuáticos (O’Farrell et al, 2002; Rodríguez et al, 2008; Bauer et al., 2012; Licursi & Gómez, 2013; Magdaleno et al, 2014; Biruk et al, 2017; Sathicq & Gomez, 2018) y diferentes alteraciones morfológicas, fisiológicas y bioquímicas en algas pueden indicar la presencia de contaminantes. De esta manera las especies que toleran ambientes contaminados son útiles como bioindicadoras del estrés ambiental y de la contaminación crónica (Rodríguez et al., 2008).
Dentro de la provincia de Córdoba, en la localidad de Bouwer, funcionó una planta recicladora de baterías ácidas emitiendo Pb al aire y dejando gran cantidad de escorias, lo que provocó que la población presentara numerosos casos de intoxicación por Pb (La voz del interior, 2006). Aún no se han aplicado medidas de remediación por lo que persiste el efecto de la contaminación del suelo sobre el ambiente (La voz del interior, 2008). Siguiendo las recomendaciones desarrolladas por la EPA (2007), para remediar una zona afectada por MP en primer lugar se necesitan remover las escorias presentes en el sitio y en segundo lugar llevar a cabo protocolos de fitorremediación con especies fitoextractoras. Entre estas últimas, Salazar & Pignata (2014) identificaron tres especies vegetales como acumuladoras de Pb, dos herbáceas nativas Bidens pilosa L. var. pilosa, Tagetes minuta L. y una introducida Sorghum halepense (L.) Pers. var. halepense. Por lo tanto conocer la riqueza de la microbiota edáfica de estas plantas aportará información relevante para su utilización en procesos de biorremediación. El presente trabajo tuvo como objetivos a) caracterizar las algas y Cyanobacteria del suelo y b) evaluar el efecto del Pb sobre la composición de comunidad de algas y Cyanobacteria presentes en la rizosfera de 3 plantas acumuladoras de Pb en la provincia de Córdoba. Se hipotetiza que la composición de algas y Cyanobacteria está afectada por la concentración de Pb en el suelo.
Materiales y Métodos
Área de estudio
El área de estudio está situada en la localidad Bouwer (455 msnm, 31° 34'05''S, 64° 10'01''O) dentro de la Provincia de Córdoba (Argentina). La misma se localiza a 18 km al Sur de la ciudad de Córdoba, con una población menor a 2000 habitantes. Los suelos de Bouwer son Haplustoles énticos, la temperatura annual media de la localidad es de 15 °C y el promedio anual de lluvias es de 500-900 mm (Gorgas & Tassile, 2003). Predominan los vientos del Norte y del Nor-Noreste, mientras que los vientos del Sur, eventuales pero muy fuertes, son los responsables del patrón de distribución del Pb en el suelo alrededor de la fuente. La vegetación predominante del área está representada por Amaranthus sp., B. pilosa, T. minuta L., Eupatorium inulifolium Kunth, Ipomoea purpurea (L.) Roth, S. halepense, Sida spinosa L., Mirabilis jalapa L., Oenothera curtiflora W.L. Wagner & Hoch, Solanum argentinum Bitter & Lillo y Lippia turbinata cf. turbinata Griseb.
La planta recicladora de baterías ácidas funcionó entre 1984 y mediados de 2005. Dicha fundición trabajó sin ningún control de las emisiones y sin disposición adecuada de los residuos, pudiendo encontrarse aún las escorias en el predio y distribuidas en todo el pueblo. Durante el funcionamiento de la fundición se presentaron en la población todas las enfermedades usualmente asociadas al Pb, principalmente en niños (La voz del interior, 2006). El nivel de las emisiones mostró un valor que excedía 35 veces lo permitido por la legislación provincial (Ley de residuos peligrosos N° 24.051). Si bien la planta se cerró definitivamente en el 2005, el área afectada no ha recibido ningún tratamiento para su remediación. En las cercanías del predio de la fundición existen viviendas y campos de cultivo, principalmente soja, por lo cual existe un potencial riesgo toxicológico tanto para la población que vive allí, como para los que consumen estos granos (Salazar et al, 2012).
Muestreo y análisis edáficos
Se seleccionaron 6 sitios en base a un gradiente creciente de Pb (qg g-1) y un sitio control (no contaminado) localizado a 2,7 km de la fábrica. La concentración de Pb en el suelo y las características edáficas se evaluaron de acuerdo a lo detallado en Salazar et al. (2018). Brevemente, se midió el pH, la condutividad eléctrica (Jackson, 1964), la materia orgánica y el carbono de acuerdo a Walkley & Black (1934), el nitrógeno total (Bremner, 1996), y el P extractable (Bray & Kurtz, 1945). La fracción de Pb intercambiable fue extraída con 1 M MgCl2 pH 7, y la fracción total extraída con HNO3 puro (Salazar et al., 2018). El grado de contaminación de estos suelos se clasificaron según el índice de geoacumulación (IGeo) (Muller, 1969) que los compara con los valores de referencia para el área de estudio. Para su cálculo se empleó la siguiente
Donde Cn es la concentración del contaminante en la muestra en estudio y Bn es el valor de referencia para la zona en la cual se recolectó la muestra. En el presente estudio, se tomó como valor de referencia una concentración de Pb en suelo de 35 qg g-1 reportado por Gorgas & Tasile (2003). El IGeo calculado para cada sitio se categorizó como: sin contaminar: <0; sin contaminar a contaminación moderada: 0-1; contaminación moderada: 1-2; contaminación moderada a alta: 2-3; contaminación alta: 3-4; contaminación alta a extrema: 4-5; contaminación extrema: >5 (Muller, 1969).
Durante el otoño del 2015 se tomaron 15 muestras de suelo (una muestra por planta y por sitio) de la rizosfera de las plantas dominantes que acumulan Pb: B. pilosa, T. minuta y S. halepense. El número de réplicas varió de acuerdo a la disponibilidad de las plantas en cada sitio (Tabla 1). Se removió la planta entera que junto con las raíces se colocaron en bolsas y almacenaron en el laboratorio a 4°C.
Obtención de cultivos, identificación y determinación taxonómica de las algas y Cyanobacteria
De cada muestra se realizaron cultivos de algas y Cyanobacteria, colocando 10 g de suelo sin tamizar, en cajas de Petri esterilizadas. Cada caja se regó con 15 ml de medio líquido Watanabe (Watanabe, 1961), se tapó y colocó en cámara de cultivo a una temperatura de 25±2 °C, con fotoperíodo de 12 hs de luz y 12 hs de oscuridad a una intensidad de 4.500 a 5.000 luxes (Halperin et al, 1973; Rippka et al., 1979). Durante el cultivo de crecimiento (9 semanas) se fue adicionando semanalmente, por caja, 10 ml de medio líquido Watanabe.
Los cultivos se controlaron cada 7 días registrando en el tiempo, para cada una de las 15 cápsulas, la presencia/ausencia de las algas y Cyanobacteria. Con el total de datos registrados durante las 9 semanas se calculó el porcentaje de frecuencia relativa (Fr) de acuerdo a la fórmula Fr= Si/N x 100, donde Si es el número de muestras con presencia de la especie “i” y “N” es el número total de muestras analizadas. La Fr de cada especie de alga se catalogó como: alta (presente entre el 61 y 100%), media (presente entre el 21 al 60%) y baja (presente en menos del 21%) (Schinquel et al, 2018).
Las especies de algas y Cyanobacteria se identificaron considerando las siguientes características morfológicas. En las Cyanobacteria, se midió la longitud total del filamento, el ancho y longitud de las células vegetativas, la morfología de las células terminales, presencia o ausencia de vaina y de heterocitos, formación de colonias y contenido celular. Para las Chloroplastida y Xanthophyceae se consideraron la morfología, las dimensiones, la cantidad y forma de los cloroplastos. Los diferentes taxones se observaron a diferentes aumentos (10, 40 y 100x) en microscopio óptico Leica CME 500 y se identificaron utilizando el sistema de clasificación: Komárek & Anagnostidis (1998, 2005), Komárek & Hauer (2013) y Komárek et al. (2013, 2014). Para Chloroplastida y Xantophyceae se utilizaron las claves de Huber-Pestalozzi (1961) y Bourelly (1981) respectivamente.
Análisis estadísticos
A fin de evaluar el efecto del Pb sobre la composición de comunidad de algas y Cyanobacteria presentes en la rizósfera de cada planta acumuladora, se construyó una matriz de disimilitud Bray-Curtis y realizó un análisis de coordenadas principales restringido al nivel Pb del suelo usando la función capscale del paquete Vegan (Oksanen, 2015). Para evaluar la significancia del análisis de coordenadas principales restringido, se realizó el test de la varianza permutacional usando la función anova.cca del paquete Vegan (Oksanen, 2015). Previamente, el efecto de la identidad de la planta sobre la comunidad de algas fue testeado usando análisis de coordenadas principales con y sin restricción. Para el resto de las variables edáficas, se hicieron correlaciones de mantel del paquete Vegan, entre estas y la composición de la comunidad de algas del suelo. Todos los análisis se realizaron en el software estadístico R (R Core Team, 2020).
Resultados
Características de los suelos
En la Tabla 1 se describen las variables edáficas de los suelos estudiados. En general los sitios bajo estudio presentaron un pH levemente básico a neutro, una conductividad eléctrica que corresponden a las fluctuaciones naturales del área, con un moderado a un muy buen contenido de carbono, nitrógeno total y materia orgánica. En todos los sitios se observó muy buen nivel de P extraíble mientras que el sitio Pb6 su nivel resultó moderado (14 ^g g-1). Con respecto a los niveles de Pb y teniendo en cuenta el índice de contaminación (IGeo) calculado, el sitio control (Pb0) presentó valores que lo califican como sin contaminar. A continuación los valores de contaminación van aumentando consecutivamente desde el Pb1 hasta el Pb6, alcanzando en los sitios Pb5 y Pb6 la máxima categoría de contaminación extrema.
Caracterización de las algas y Cyanobacteria del suelo
En el presente estudio se identificaron en las muestras analizadas 24 especies pertenecientes a Cyanobacteria, Chloroplastida y Xanthophyceae. La mayoría de las especies (22) fueron Cyanobacteria: 9 Oscillatoriales (Coleofasciculaceae, Oscillatoriaceae y Pseudoanabaenaceae), 9 Nostocales (Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae) y 4 Synechococcales (Leptolyngbyaceae) (Tabla 2). Mientras que sólo se identificó 1 especie de Chloroplastida y de Xanthophyceae (Tabla 2).
A lo largo de las 9 semanas, se fue registrando la presencia/ausencia de las algas y Cyanobacteria. En las primeras semanas de crecimiento de los cultivos, se observó la presencia de Cyanobacteria no heterocitadas: Oscillatoria, Phormidium y Leptolyngbya acompañadas por el alga verde Trebouxia parmeliae y la Xanthophyceae Vaucheria sp. Posteriormente aparecieron los géneros heterocitados Cylindrospermum, Calothrix y Nostoc. Hacia el final del cultivo las Cyanobacteria no heterocitadas, T. parmeliae y Vaucheria sp. se reemplazaron por las siguientes especies heterocitadas: Cylindrospermum muscicola, C. maius, Nostoc commune, N. muscorum, Calothrix clavata y Scytonema bohneri.
La frecuencia relativa (%) final de cada especie de alga y Cyanobacteria en relación al total de muestras de las distintas especies vegetales (S. halepense, B. pilosa y T. minuta) y los contenidos de Pb se observa en la Tabla 2. Para las Nostocales Cylindrospermum muscicola (53,33%), Nostoc commune (40%) y Calothrix clavata (26,67%) la frecuencia relativa fue media. El resto de las algas presentó una frecuencia baja (menos del 21%). En relación a la Chloroplastida y la Xanthophyceae la frecuencia relativa fue la más alta para Trebouxia parmeliae (73,33%) y media para Vaucheria sp. (46%) respectivamente (Tabla 2, Fig. 1).
Comunidad de algas y Cyanobacteria en plantas acumuladoras de Pb
En la Figura 2 se observa la riqueza de especies de algas presentes en la rizósfera de las 3 plantas estudiadas en los diferentes sitios muestreados. La mayor parte de las especies de algas se concentraron desde los sitios categorizados como “sin contaminar” (Pb0) a los sitios con “contaminación moderada a alta” (Pb1, Pb2, Pb3) (Fig. 2). Bajo la rizosfera de Bidenspilosa y Sorghum halepense, el alga Trebouxia parmeliae fue la única especie presente en el sitio con contaminación extrema de Pb (Pb6) (Tabla 2).
El efecto de Pb sobre la composición de la comunidad de algas de la rizosfera de las 3 plantas acumuladoras evaluadas en el presente estudio (B. pilosa, T. minuta y S. halepense) se muestra en la Figura 3. Independientemente de la especie vegetal de origen de la muestra, se observa una clara separación entre sitios de acuerdo al nivel de Pb del suelo (Eje 1), a la izquierda los sitios cuya categoría va desde sin contaminar a contaminacion moderada a alta (Pb0, Pb1, Pb2, Pb3) y a la derecha los sitios con contaminación alta a extrema (Pb4, Pb5, Pb6). Mientras que el Eje 2 muestra el escalamiento multidimensional de la comunidad de algas. En efecto, el análisis de coordenadas principales restringido al Pb (Eje 1) explicó el 87,3% de la variabilidad y fue estadísticamente significativo según el análisis de varianza permutacional (p<0,025). No se observaron efectos significativos de la identidad de la especie vegetal (P>0,465) ni con el resto de las variables edáficas (P>0,05) sobre la comunidad de algas y Cyanobacteria del suelo.
Discusión y Conclusiones
Las algas son ubicuas y constituyen un componente importante de la biomasa microbiana edáfica (Fu & Secundo, 2016) y en suelos contaminados pueden ser usadas como indicadores para evaluar el riesgo ambiental de los contaminantes (Subashchandrabose et al, 2013). En el presente trabajo, el número total de especies (24) fue similar a la riqueza de especies halladas en suelos mineros contaminados con Zn y Pb de Polonia (Trzcinska & Pawlik-Skowronska, 2008), en suelos contaminados con Cu y Ni en Canadá (Maxwell, 1991) y suelos contaminados cercanos a una planta de fundición en Romania (Shubert et al, 2001). Las Cyanobacteria fueron el grupo más frecuente (22 especies) registrado en la rizosfera de las plantas estudiadas; esto también fue observado para un relicto de monte de la provincia de Córdoba (Schinquel et. al., 2018, Murialdo et. al., 2019), en un suelo de la provincia de Buenos Aires (Tell, 1976) y en suelos contaminados de Egipto (Hifney et al., 2009). Esto podría ser explicado si consideramos que Cyanobacteria es un grupo bien adaptado a una gran variedad de condiciones ambientales y de sustratos (Kulal et al., 2020).
Respecto al crecimiento de los cultivos se observó un reemplazo de especies no heterocitadas -Oscillatoria, Phormidium y Leptolyngbya-a heterocitadas -Cylindrospermum, Calothrix y Nostoc-. Este tipo de sustitución de Cyanobacteria en el tiempo ya ha sido observado por Schinquel et al. (2018). Tanto la calidad espectral (longitud de onda) como el fotoperíodo son factores medioambientales que controlan el crecimiento y la diferenciación de las algas edáficas en el laboratorio (Meting, 1981). Se ha demostrado en experimentos que la diferenciación de heterocitos es luz-dependiente además de asociarse a deficiencias de nitrógeno en el ambiente ya que les permiten fijar N atmosférico (Kumar et al, 2010). Aunque las variables (fotoperíodo y disponibilidad de N) se mantuvieron constantes a lo largo de toda la experiencia, se deberían realizar nuevos ensayos, que involucren mayor número de réplicas, estudiando los mecanismos de formación y la sustitución de especies de Cyanobacteria en el tiempo.
Una mayor frecuencia de Cyanobacteria heterocitadas se observó en suelos contaminados con Pb. Los géneros identificados en este trabajo ya han sido descriptos por Gupta et al. (2012) en situaciones estresantes de alta salinidad. Además, bajo condiciones de laboratorio se ha reportado la remoción de Pb por Cyanobacteria del género Gloeocapsa y Synechocysistis sp. (Raungsomboon et al., 2008; Roy et al., 2008). En el presente trabajo, las Nostocales Cylindrospermum muscicola, Nostoc commune y Calothrix clavata son capaces de tolerar y crecer en suelos contaminados con Pb.
En términos generales, la tolerancia y resistencia de las algas verdes se puede relacionar a la capacidad de adelgazar temporalmente su cobertura celular ante condiciones desfavorables, a la desintoxicación efectiva de los contaminantes, y a sus propiedades fisiológicas y bioquímicas del protoplasma (Nalewaiko & Olaveson, 1995; Temraleeva et al., 2011). Las algas verdes pueden resistir diferentes tipos de contaminantes antropogénicos, incluída la contaminación por MP (Kuzyakhmetov, 1998; Novakovskaya & Patova, 2007). En este trabajo se observó que Trebouxia parmeliae (clorófita) y la Vaucheria (xantófita) presentaron alta frecuencia en los suelos con contaminación extrema de Pb (Pb5 y Pb6). Más aún, en Pb6 Trebouxia parmeliae fue el único organismo existente. Las especies del género Trebouxia representan un ejemplo de los fitobiontes más exitosos asociados a especies de líquenes de ambientes extremos (articoalpino, antarctico y desiertos) (Honegger, 1991). Se ha observado que cuando Trebouxia spp. está asociada formando líquenes presenta habilidades extremadamente diversas para evitar que el Pb ingrese al citoplasma interfiriendo en procesos citoplasmáticos. Entre estas habilidades, se ha demostrado la acumulación del metal en la pared celular para algunas especies de Trebouxia, y la acumulación en vesículas para otras (Alvarez et al., 2012). Adicionalmente, algunos metales como Cd, Cu y Hg son tolerados por Trebouxia irregularis y T. erici (Backor et al., 1998; Backor & Vaczi, 2002). Sin embargo, y lo novedoso de este trabajo, es que Trebouxia raramente es encontrada en ambientes naturales de forma libre (Bubrick et al., 1984; Honegger, 1991).
La otra especie más frecuente en el suelo contaminado con Pb fue Vaucheria sp. Tell (1976) observó, a ojo desnudo, biodermas de este género en distintos lugares de los suelos de la Provincia de Buenos Aires. Con respecto a los metales pesados, experimentalmente Temraleeva et al. (2011) no observaron una respuesta de crecimiento de este género bajo tres niveles (medio, alto y muy alto) de contaminación por Pb. Por otro lado, Christ et al. (1980) reportaron acumulación de Cu en sus paredes celulares. En coincidencia con nuestros resultados, estas algas en general ocurren en sitios afectados por la industria y expuestos a la contaminación por MP (Skowronski et al, 1998).
Los MP actúan como agentes de selección y permiten establecer ecotipos tolerantes a ellos. En este trabajo, la riqueza de especies disminuyó a medida que aumentó la concentración de Pb en el suelo y las especies más resistentes fueron Cylindrospermum muscicola, Nostoc commune, Trebouxia parmeliae y Vaucheria sp. Una disminución en la riqueza de algas a medida que aumenta la concentración de MP en el suelo (Cd, Ni y Pb) fue también observada por Hifney et al. (2009). Varias especies de Cyanobacteria y Chlorophyta son tolerantes a diversos MP tales como Cu2+, Cd2+, Pb2+ o Zn2+ (Foster, 1982; Trzcinska & Pawlik-Skowronska, 2008). Conocer la variedad y composición de especies de algas en suelos contaminados es un bioindicador útil de polución (Trevors, 1984; Fu & Secundo, 2016).
Las plantas estudiadas en este trabajo, S. halepense, T. minuta y B. pilosa, son tolerantes a los MP y acumulan Pb (Salazar & Pignata, 2014). La función directa de las algas asociadas a la rizosfera es la de alterar la concentración y/o acumulación de metales dentro de los tejidos vegetales, exhibiendo de esta forma mecanismos de remediación y desintoxicación de MP (Mahmood et al., 2015). A pesar de que no se observaron efectos significativos de la especie vegetal sobre la comunidad de algas, en la rizosfera de algunas plantas se observó un mayor número de especies de algas y Cyanobacteria a bajas concentraciones de Pb. La función biológica del Pb en las algas es incierta (Pawlik-Skowronska, 2000), pero se sabe que el Pb tiene efectos adversos en la morfología, crecimiento y fotosíntesis cuando se presenta en alta concentración (Pawlik-Skowronska, 2002). En el presente trabajo, independientemente de la especie vegetal presente, se observó un efecto del nivel de Pb sobre la composición de la comunidad de algas y Cyanobacteria apoyando nuestra hipótesis. Este efecto se traduce en un agrupamiento de especies de algas que toleran bajos niveles de contaminación y algunas pocas especies niveles de contaminación alta a extrema.
El uso de los microorganismos constituye una estrategia potencialmente viable para la recuperación de suelos degradados por contaminación. Las algas reflejan la concentración de MP en el ambiente y son considerados como buenos bioindicadores. Este trabajo muestra por primera vez que en la rizosfera de plantas capaces de acumular Pb predominaron Cyanobacteria heterocitadas y que T. parmeliae y Vaucheria sp. se asocian a niveles de contaminación extrema de Pb. Además, se observó un efecto del Pb sobre la riqueza de especies de la comunidad de algas y Cyanobacteria en la rizosfera de las plantas evaluadas. Conocer los microorganismos que se adaptan a ambientes extremos, conocer sus mecanismos de acumulación de MP y desarrollar diferentes técnicas biocorrectivas son algunas de las alternativas a tener en cuenta para la recuperación de los suelos contaminados de Bouwer en Córdoba.
Contribución de los autoresAGB y MJS diseñaron la investigación. AGB, EM, MJS coleccionaron el material de campo. CD y RM identificaron los materiales y VF analizó los datos estadísticos. Todos los autores participaron en la escritura del manuscrito.